文献支持文库构建 /crispr敲除/shRNA干扰/过表达/CRO服务

提供商 ：云舟生物科技（广州）股份有限公司

服务名称 ：CRISPR/shRNA文库构建

云舟生物在设计和构建高复杂性的大规模功能筛选文库方面具有丰富的经验。无论您是正在研究基因功能、CRISPR或RNAi功能筛选、调控元件还是细胞谱系分析，我们的专家团队都致力于根据您的特定研究目标提供高质量的定制文库。我们的文库产品使用了下一代测序（NGS）进行全面验证，因此您可以确切地了解您购买的文库信息。

1. 定制文库构建服务：
（1）CRISPR文库亮点

• 高多样性： 我们的CRISPR文库拥有从数百至10⁶的高度复杂度。
• CRISPR文库设计经验丰富： 我们对于多种类型的CRISPR文库针对不同种类的筛选策略拥有丰富的设计经验，包括但不限于CRISPR KO（单gRNA或双gRNA）、CRISPRa、CRISPRi、单细胞CRISPR技术、CRISPR barcoding技术等。
• 高度灵活的载体设计： 我们可根据您的需求为您设计合适的文库载体，使用不同的递送系统、启动子、标记基因、barcode等。
• 高质量病毒包装： 我们可包装多种病毒系统，周期短、性价比高
• 高覆盖率、高均一性： 我们设计的载体变体其文库可达>98%的覆盖率

云舟生物CRISPR文库的复杂度、覆盖率和序列比对的一致性。来自于云舟生物构建的CRISPR文库的数据以无偏好方式进行收集和分析。（A）文库复杂度范围从10²到>10⁵。（B）gRNA的覆盖率和读取的比对率均很高，表明我们的文库具有出色的覆盖率和低错误率。

（2）shRNA文库亮点

• 高多样性： 我们的shRNA文库拥有从数百至10⁶的高度复杂度。
• 高度灵活的载体设计： 我们可根据您的需求为您设计合适的文库载体，使用不同的递送系统、启动子、标记基因、barcode等。
• 高质量病毒包装： 我们可包装多种病毒系统，周期短、性价比高。
• 高覆盖率、高均一性： 我们设计的载体变体其文库可达>98%的覆盖率。

shRNA均一性在人和小鼠精华基因小库（针对PubMed Central上约2,000个最常被引用的基因）中的分布。shRNA读长分布按NGS文库大小（1,000万reads）标准化，并以log2比例绘制。NGS测序深度为300x。

（3）Barcode文库亮点

• 高多样性： 我们的shRNA文库拥有从数百至10⁸的高度复杂度。
• 核苷酸分布高均一性且无偏向性
• 全面的技术支持： 我们拥有经验丰富的科学家为您的barcode文库设计提供技术支持，帮助您选择最佳的barcode生成和文库克隆策略。

  一个N₍₂₁₎barcode的核苷酸分布，使用简并核苷酸策略显示每个位置的A、C、G、T的百分比。该图表明在所有位置的核苷酸比例分布相近。

（4）增强子/启动子文库亮点

• 多种克隆策略：我们可根据您的研究目的采用各种组合方法构建增强子/启动子文库。
• 高多样性：我们可以生成复杂度超过10⁸的增强子/启动子文库。
• 经过优化载体设计：我们的文库载体经过优化，具有很高信噪比，可以解决当前增强子/启动子筛选中常遇到的瓶颈问题。
• 荧光报告基因：我们的载体整合了荧光报告基因便于观察和细胞分选。
• 条形码：引入barcode序列，可使用NGS分析上游调控元件的转录活性。

构建针对视锥细胞的启动子文库并进行验证。（A）构建、筛选和验证的工作流程。利用四个成熟的感光器特异性启动子作为DNA洗牌的亲本序列。其中一些已被证明能够驱动视锥细胞的基因表达。进行DNA洗牌后，将这些新变体序列克隆到AAV骨架中，驱动一个绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的表达。这些重组AAV携带不同的启动子变体被注射到小鼠的视网膜下区域。随后，使用荧光成像、细胞分选和下一代测序（NGS）筛选具有视锥细胞特异性的启动子变体。（B）定制的视锥细胞特异性启动子文库的验证。为了验证启动子文库的特异性，检测了GFP的表达情况（左）。观察到的表达情况与已知的合成的视锥细胞特异性启动子ProA1相似，后者驱动Td Tomato的表达（中）。这表明定制文库具有针对视锥细胞的特异性。

（5）突变文库亮点

• 多种克隆策略： 我们根据您的研究目的采用各种组合方法构建突变库。
• 高多样性： 我们能够生成复杂度超过10⁸的突变文库。
• 覆盖率、均一性高： 我们的突变文库通常可实现对靶突变>98%覆盖率。

图1 质粒文库(NNK)₁₁的核苷酸构成

该文库采用NNK简并密码子策略构建。每根柱子代表DNA序列中不同的核苷酸位置，颜色表示观察到的核苷酸类型。所有位置都显示出预期的核苷酸，且观察到的频率接近理论值（N = 25% A + 25% T +25% G + 25% C，K = 50% T + 50% G）。


 

图2 质粒文库7-mer可变区的氨基酸分布

该文库利用NNK简并密码子策略构建而成。每根柱子分别代表理论（绿）/实际（红）上的特异氨基酸/终止密码子的百分比。观察到的20种氨基酸和终止密码子的实际频率与理论频率非常接近。

图3 云舟生物芯片合成的寡核苷酸文库。图示为复杂度、覆盖率和序列比对的一致性。

数据以无偏向的方式收集于云舟生物使用芯片合成寡核苷酸文库。（A）这些定制文库的大小分布高度多样化，复杂度从10²到超过10⁵不等。（B）覆盖率和读取的比对率均很高接近100%，突出表明了我们文库的极高准确性和低错误率。

（6）AAV衣壳文库亮点

• 全方面的服务平台：载体家是当前全球唯一一家具备AAV临床前、临床CRO和CDMO一站式服务的企业。我们的AAV相关服务涵盖载体设计、载体优化、载体克隆、文库构建、病毒包装、衣壳定向进化和工程改造、AAV组织分布鉴定、GMP病毒生产等。
• 多策略定向进化构建衣壳高度多样性的病毒文库：我们在文库构建方面的丰富经验，可以帮助您通过定向进化以及其结合方法进行自定义设计，以获得极具病毒衣壳多样性的文库。
• 文库病毒高滴度包装：我们可使用一步法或两步法包装文库病毒，并保证每种衣壳或基因组发生突变的病毒均具有很高的滴度。
• 使用包括非人灵长类（Non-human primate，NHP）在内的多种模式生物进行体内筛选：除了进行体外筛选，我们还提供一系列模式生物用于进行体内筛选，如小鼠、大鼠、以及重要的两种非人灵长类：食蟹猴（Macaca fascicularis）和猕猴（Macaca Mulatta）。所有体内筛选试验均在经过AAALAC认证的机构中以专业认可的方式进行。
• 完善的技术支持：我们的科学家在AAV衣壳开发项目上具有深厚的经验，能够为您提供全面的技术支持，包括从文库设计、文库构建到体内筛选以及NGS分

2.  预制文库：
（1）CRSIPR文库

我们提供的CRISPR文库产品类型：

• 全基因组CRISPR基因敲除文库
• 全基因组CRISPRa文库
• 全基因组CRISPRi文库
• 特定通路CRISPR基因敲除文库

全基因组CRISPR基因敲除文库：



全基因组CRISPRa文库：



全基因组CRISPRi文库


 

特定通路CRISPR基因敲除文库


 

CRISPR文库的规格和滴度

（2）shRNA文库：