文献支持哺乳动物基因普通表达Tol2转座载体

提供商 ：云舟生物科技（广州）股份有限公司

服务名称 ：提供定制载体

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概述

我们的Tol2载体系统能高效地将外源DNA插入宿主细胞基因组中。该系统技术简单，利用质粒转染（非病毒转导）将目的基因永久整合到宿主基因组中。
 

该系统来源于Tol2转座子，它最初是从硬骨鱼青鳉鱼（Oryzias latipes）中分离出来的。 基于序列同源性分析，发现Tol2转座子与整个脊椎动物基因组中发现的非自主元件的hAT家族密切相关。
 

Tol2系统包含两个载体，一个载体被称为辅助质粒，负责编码转座酶；另一个载体被称为转座子质粒，包含两个反向末端重复序列（ITRs）以及两者之间的转座区域，需要被转座到宿主基因组中的目的基因就克隆在这个区域。
 

当辅助质粒和转座子质粒共转染靶细胞时，辅助质粒产生的转座酶将会识别转座子的两个ITR，然后将被转座区和两个ITR元件插入到宿主基因组中。Tol2转座子在宿主细胞中的插入位点没有明显碱基偏好性，这不同于具有特定靶标位点的转座子系统。如，piggyBac转座插入通常发生在包含TTAA序列的宿主染色体位点。
 

Tol2是II类转座子，通过“剪切—粘贴”的机制移动，从一个地方转座到另一个地方，而不留下序列本身（恰好相反，I类转座子是通过“复制—粘贴”的方式移动）。Tol2通过“剪切-粘贴”机制以单拷贝进行整合，在每一个插入位点都会产生一个8 bp的重复序列。
 

有两种途径可将转座酶导入靶细胞。第一种是将辅助质粒瞬时转染到细胞中，使转座酶的瞬时表达。 第二种是利用辅助质粒体外转录出Tol2 mRNA，然后注射到靶细胞中。无论哪种情况，转座酶都只能短时间表达。 随着辅助质粒的丢失或转座酶mRNA的降解，转座子会永久整合到宿主基因组中。如果将Tol2转座酶重新导入细胞中，整合的转座子会再次通过“剪切—粘贴”的机制移动。

 

亮点

Tol2转座子载体系统可将高达11 kb的序列有效插入到靶细胞基因组中。我们的Tol2转座子载体与辅助质粒是经过优化的，可在大肠杆菌中高拷贝复制。该载体系统对多种类型的靶细胞均具有高效的转导效率，实现外源基因的高水平表达。

 

优势

外源基因的永久整合：常规质粒转染只能实现外源基因的瞬时表达，这种外源基因会随着宿主细胞的分裂而不断丢失，在快速分裂的细胞中显得尤为显著。相反，将Tol2转座子载体和辅助质粒（或者Tol2 mRNA）一起转染到哺乳动物细胞中，由于转座子在转座酶的作用下，目的基因能稳定地整合到宿主细胞的染色体中，从而实现转座子载体上携带的目的基因在宿主细胞中永久表达。
 

技术简单：通过常规转染即可把质粒转入细胞，相比起病毒载体需要进行病毒包装，过程更简单。
 

载体容量大：我们的转座子载体总容量可达11 kb，其中质粒骨架只占3 kb，有足够大的容量可以放置客户所感兴趣的序列。

不足之处

转染细胞类型受限：Tol2载体进入细胞依赖于转染。不同类型的细胞，其转染效率差异非常大。非分裂细胞通常比分裂细胞更难转染，原代细胞比永生化细胞更难转染，一些重要的细胞类型转染难度更大，如神经元和胰岛β细胞。另外，质粒转染主要局限于体外应用，很少应用于体内实验（但可以应用于转基因动物模型制备）。以上因素在一定程度上制约了Tol2系统的应用。

 

载体关键元件