两管式RT-PCR试剂盒(AMV-Taq)

保存条件 ：-20℃

保质期 ：两年

英文名 ：Two-Tube RT-PCR Kit

库存 ：900

供应商 ：上海烜雅生物科技有限公司

两管式RT-PCR试剂盒(AMV-Taq)产品及特点：
本试剂盒是整合 cDNA 第一链合成试剂和即用型 PCR 试剂而得的 RT-PCR 试剂盒。cDNA 第一链合成反应和 PCR 反应分别在两个离心管中进行。本试剂盒具有下列特点：
1. 即开即用，足够 50 次 RT 反应（20 uL 体系）和 600 次 PCR 反应（30 uL 体系）。
2. cDNA 第一链合成试剂盒可灵活选用随机引物、Oligo dT 引物或基因专一引物，适合各种情况。
3. PCR 试剂盒具有即用、简单等优点，PCR mix 中含上样染料，所以 PCR 产物可以直接上样电泳。
4. 两管式操作，RT 和 PCR 在不同试管中进行，便于单独优化 RT 反应或 PCR 反应条件。
5. 扩增效率高, 最长可扩增 5 Kbp 以上的 RNA。

两管式RT-PCR试剂盒(AMV-Taq)运输及保存：
低温运输,-20℃保存, 有效期一年。
自备试剂：样品 RNA、模板专一正向和反向引物。

两管式RT-PCR试剂盒(AMV-Taq)使用方法
一、样品 RNA 的制备（本试剂盒不提供相关试剂）
1、可用自本公司各种 RNA 提取方法提取样品的 RNA，也可以选用其他供应商的产品，但得到的 RNA 一定要溶解在 RNase-free 的超纯水中。

两管式RT-PCR试剂盒(AMV-Taq)二：RT（逆转录）反应合成 cDNA
1. 按下表配制 RT 反应体系（20 uL 体系）:
RNA 模板
总 RNA                                                      100-500 ng
或 poly(A) mRNA                                        10-500 ng
或专一的 RNA（如体外转录制备的）             0.01 pg-500 ng

引物
Oligo (dT)18(0.5 ug/uL)                                1 uL
或随机引物(0.2 ug/uL)                                   1 uL
或自备模板专一反向引物(10 pmol/uL)             1-2 uL
RNase-free 水                                               补水到 12 uL
两管式RT-PCR试剂盒(AMV-Taq)注意：RNA 样品不能含有基因组 DNA 污染。随机引物与 RNA 模板的比例将决定cDNA 合成的平均长度（成反比）。一般情况下随机引物效率好于 OligodT 引物，但如果只想转录总 RNA 中的 mRNA（只占 5%左右），则可优先选用 OligodT 引物，这样就可以排除非 mRNA 的干扰。
2. 70℃保温 5 分钟变性模板后立即冰浴。
3. 按顺序加入 6 uL RT Buffer（含 dNTP）和 2 uLMMLV 逆转录酶（含 RI），反应终体积为 20 uL。
4. 42℃保温 60 分钟。此步为 RT 反应。
5. 70℃保温 10 分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。
6. 合成的 cDNA 可以直接作为 PCR 模板使用，不需要纯化。剩余样品可以放置在-20℃长期保存。

两管式RT-PCR试剂盒(AMV-Taq)三、PCR（30 uL 体系）
1、将全部专用染料加入到 PCR MagicMix 3.0 中，轻柔颠倒混匀即可使用。未用完的部分需要在-20℃。也可以不加专用染料，但在 PCR 结束后，电泳上样前，则需要加入电泳上样液，否则电泳时没法判断电泳速度。
2、在 PCR 管中加入下列成分：
成分                                                      加入量
PCR MagicMix 3.0（已加染料）              15 uL
cDNA 样品（上步的 RT 反应液）             1-5 uL
模板专一性正向引物(10 pmol/uL)            1-2 uL
模板专一性反向引物(10 pmol/uL)            1-2 uL
补水到                                                   30 uL
两管式RT-PCR试剂盒(AMV-Taq)注意：cDNA 也可以稀释后用作 PCR 模板。是否稀释或稀释多少倍完全取决于靶基因的丰度。
2、PCR 反应参数(需要根据模板和引物决定，下面的只做参考)：
过程                                    温度                  时间
预变性                                 94℃                 5 min
PCR 反应（35 个循环）         94℃                 1 min
                                           55℃                 1 min
                                           72℃                 2 min
最后延伸                              72℃                 10 min

两管式RT-PCR试剂盒(AMV-Taq)四、电泳检测
1、取 5-0 uL PCR 产物直接在 PAGE 或琼脂糖凝胶上电泳，跟分子量标准比较估计出扩增产物的大小。注：本试剂盒中的 PCR mix 含有甘油和染料，可以直接上样，不需要额外再加电泳上样液。

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