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文献和实验
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保存条件 :常温运输和保存
保质期 :两年
英文名 :Random Primer DNA Labeling Kit
库存 :890
供应商 :上海烜雅生物科技有限公司
随机引物法DNA探针Digoxin标记试剂盒产品及特点:本产品是基于Feinberg和Vogelstein发明的随机引物标记法而开发出来的即用型DNA探针标记试剂盒,标记过程由双链DNA热变性、随机引物与单链DNA结合、在KlenowDNA聚合酶催化下,引物的延伸合成DNA探针并掺入标记的核苷酸三步组成,可用下面的示意图表示:
随机引物法DNA探针Digoxin标记试剂盒本产品对Feinberg和Vogelstein经典方法进行了改良,具有下列特点:
1.提供的标记反应液整合了除酶和模板外的所有成分,简化了反应加样步骤,提高了标记反应的可重复性。
2.使用无外切活性的Klenowexo-DNA聚合酶,已标记DNA探针不会被酶降解。
3.快速,最快1小时即可完成标记反应。
4.得到的DNA探针比活性高(如果是同位素,可以达到109cpm/ugDNA)。
5.所需模版DNA量少,可以是各种形状(线状和环状)的、也可以是单链或双链的,但长度必须在100bp以上。
6.得到的探针长度在200-400nt之间,可以用于Southern杂交、Northern杂交、原位杂交、菌落和斑点印迹杂交等。
7.提供三种标记选择,其中A可用于各种同位素和非同位素标记,但需自备标记底物;B和C可分别用于生物素和标记,不需自备标记底物。
随机引物法DNA探针Digoxin标记试剂盒运输及保存:
低温运输,-20℃保存,有效期一年。
自备试剂:0.5MEDTA(pH8.0)。如果是A型,则需要自备标记的核苷酸。
随机引物法DNA探针Digoxin标记试剂盒使用方法
1.在一干净的硅化的塑料离心管中加入下列成分:
成分 用量
模板DNA 50-150ng
2×随机引物标记反应液(ABC三种之一) 10uL
超纯水 补水到15uL
随机引物法DNA探针Digoxin标记试剂盒注意:非同位素标记基团疏水性强,易与塑料离心管表面非特异性结合,所以要硅化塑料离心管。模板DNA并非越多越好,否则会竞争性地抑制探针跟靶分子的杂交。
2.沸水浴5-10分钟,或在PCR仪上100℃加热5-10分钟后立即放冰上待用。
3.高速离心数秒使所有液体集中在管底,根据试剂盒类型加入下列成份:
试剂盒类型 成分及用量
A型 dATP、dGTP、dCTP各1uL(共3uL,浓度均为2mM)自备的2mMdTTP/标记dUTP混合物(见注)1uL 1uLKlenowexo聚合酶
B型 1uLKlenowexo聚合酶 4uL超纯水 不需加dNTP,已经包括在2×随机引物标记反应液(B型)中
C型 1uLKlenowexo聚合酶 4uL超纯水 不需加dNTP,已经包括在2×随机引物标记反应液(C型)中
随机引物法DNA探针Digoxin标记试剂盒注:上表中的dTTP/标记dUTP混合物中dTTP和标记的dUTP的总浓度为2mM,dTTP与标记dUTP的比例在65:35为最佳。但如果使用自备的其他标记核苷酸,如fluorescein、hydroxycoumarin、resorufin和aminoallyl标记的dUTP,则用户需要自己摸索其与dTTP之间的最佳比例,如果使用32P标记的dUTP,则比活最好为3000Ci/mmol,浓度为好为10uCi/uL,并且不需要加入dTTP。
4.轻柔吹打混匀。如有液滴沾在管壁上,高速离心数秒使所有液体集中在管底。
5.37℃保温1-20小时。标记效率跟模板量和保温时间相关,具体见下表:
6.加1uL自备的0.5MEDTA(pH8.0)终止反应,加热100℃5分钟使DNA探针变性成单链,然后直接加入到杂交反应液中即可。如果电泳检测,标记产物将是弥散状态。立即放冰上待用或放-20℃保存一年。用前需要
随机引物法DNA探针Digoxin标记试剂盒注意:本方法标记核苷酸掺入率极高,因此可以不经纯化直接使用。如果需要纯化,注意不要用酚抽提法纯化非同位素标记的DNA探针,因为这些标记分子疏水性强,能使标记的DNA进入疏水的有机相而丢失,但可以用乙醇沉淀和SephadexG50回收(可另购柱式探针纯化试剂盒)。对比活高的同位素标记探针,由于同位素其极其不稳定,因此应该立即使用,不要长久放置。
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