柱式植物mtDNAout，测序级价格_品牌:xuanya-丁香通官网

保存条件：常温运输和保存

保质期：两年

英文名：Column Animal Mitochondria DNA Purification Kit

库存：860

供应商：上海烜雅生物科技有限公司

柱式植物mtDNAout，测序级产品及特点：
线粒体是非常重要的细胞器，它不但跟很多人类疾病相关，而且还是母系遗传研究的重要材料。对线粒体进行遗传研究和进化研究都需要纯化线粒体DNA。本产品先纯化动物细胞线粒体、再从中纯化其DNA。它具有下列特点：
1.即开即用，用户不需要自己配制各种溶液，优化各种条件。
2.两步法，先纯化线粒体，再柱式法纯化其中的DNA，基因组DNA污染少。
3.本产品可以用15次，一次可以处理约1×108个培养细胞（相当于5瓶150mm培养细胞），可以纯化到到0.2-0.5mg线粒体。
4.适用于各种动物悬浮培养细胞和贴壁培养细胞，不建议用于动物实体组织。
5.提供线粒体染液，可以在操作中随时监测纯化过程中线粒体的完整性。

柱式植物mtDNAout，测序级运输及保存：
常温运输和保存,保存期限一年。其中有3个成分放低温成分袋，低温运输，-20℃保存。
自备试剂：PBS缓冲液、氯仿、0.5MEDTA溶液（pH8.0）。人TPMTVNTR的上游引物为5GCTCCGCCCTGCCCATTT3，下游引物为5GCCTCCGCCACCAATGAC3，人线粒体HV2区的上游引物为5GGTCTATCACCCTATTAACCAC3，下游引物为5CTGTTAAAAGTGCATACCGCCA3。

柱式植物mtDNAout，测序级使用方法
注意：线粒体膜对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或冷室进行，溶液和离心管都需预冷。

柱式植物mtDNAout，测序级一：准备工作。未用完的下列溶液需要-20℃保存，否则容易长菌。下次使用前需溶解沉淀并摇匀。
1.将50mL溶液A和250mL溶液B放冰上预冷待用。
2.配制1.0M低比重溶液100mL:将34克蔗糖用100mL溶液B溶解并放冰上待用。
3.配制线粒体重悬液100mL:将75mL溶液B和25mL1.0M低比重溶液混合，冰上待用。

柱式植物mtDNAout，测序级二：线粒体粗提
4.如果提取材料是单层培养细胞，先用20mL自备的PBS缓冲液洗涤1×108个培养的单层细胞，共洗涤2次。然后用塑料刮匙刮下细胞，重悬在20mLPBS缓冲液中。如果是悬浮细胞，则1000g4℃离心10分钟收集1×108个细胞，再用20mL PBS缓冲液洗涤2次，最后将细胞重悬在20mLPBS缓冲液中。
5.用平甩转子（swinging-bucketrotor）离心机1000g 4℃离心10分钟，弃上清留沉淀。
6.加入5倍体积(以细胞沉淀的体积为基数)的预冷的溶液A，轻柔重悬细胞。
7.冰上放置4-5分钟。注意：冰浴时间不要超过5分钟。
8.如果是成纤维细胞，由于其难以裂解，可将细胞重悬液在-80℃放置20-30分钟后再化冻，然后进入下步操作。如果不是成纤维细胞，则直接进入下步操作。
9.将细胞重悬液体转移到预冷的Dounce玻璃匀浆器中（工作体积为10-15mL，间隙为0.12mm，最好是玻璃材质，否则线粒体产率会降低）匀浆适当次数。细胞株不同，其最适匀浆次数不同，一般需要40次-60次左右。匀浆是线粒体纯化最关键的步骤，故匀浆前最好先通过预实验确定最适匀浆次数，方法是每匀浆5-10次后，取2-3uL匀浆液到载玻片上，然后在相差显微镜下观察，完整细胞数量降低到20%以下为佳。
10.加入1/3体积的、预冷的1.0M低比重溶液，轻柔混匀。
11.用平甩转子离心机4℃1000g离心10分钟。沉淀含残留完整细胞、细胞碎片和细胞核，上清液含线粒体。
12.转移上清液到离心管中，冰上放置。在显微镜下检测上清液中线粒体的完整性。具体做法是先滴50uL左右上清液到载玻片上，再滴入50uL詹纳斯染液绿B染色液20分钟，油镜下观察，蓝绿色颗粒状物即为线粒体。
13.用固定角度转子（fixed-anglerotor）离心机4℃15,000g离心15分钟，弃上清，所得棕黑色沉淀即为粗提线粒体沉淀。
14.用5mL线粒体重悬液重悬线粒体，4℃15,000g离心15分钟，弃上清。
15.重复上步一次。
16.如果后续实验是提取mtDNA用于PCR或Southern杂交，则直接进入第4部分mtDNA提取，也可以放-80℃长期保存待用。如果后续实验是提取mtDNA用于高通量测序，则必须彻底降解掉其中的细胞核DNA污染。匀浆过程中一个破裂的细胞核释放出的DNA相当于上百万个线粒体的DNA量之合，所以无论如何小心，粗提线粒体中必有大量的细胞核DNA污染，如果不将其清除，高通量测得的序列将绝大部分来于核DNA而非mtDNA。三：细胞核DNA的去除及鉴定
17.将线粒体重悬于0.3mL预冷的线粒体重悬液中，取10uL作为未处理线粒体（后面将使用）。
18.加入6uLBenzonase（1U/uL）溶液和30uLDNaseA溶液（配法：将0.5mL10×DNaseA反应液加到装有5mgDNaseA干粉的离心管中得到10mg/mLDNaseA溶液，未用完的此溶液需要分装后放-20℃保存）。
19.37℃保温一段时间酶切细胞核DNA。注意：最好先预实验，每隔一段时间取10uL样品，灭活其中的DNase后作为模板用PCR扩增人基因组TPMTVNTR位点和人mtDNAHV2区(两基因的PCR引物见自备试剂)，检测不到VNTR基因而能检测到mtDNA基因的处理时间为最佳。相关引物和PCR试剂需要自备。可用未处理线粒体做对照。
20.加入10uL自备的0.5MEDTA溶液（pH8.0）以终止酶反应。詹纳斯绿B染色并在显微镜下检查线粒体完整性（操作见上）。
21.4℃ 10,000g离心10分钟，弃上清。
22.用1mL的预冷线粒体重悬液重悬线粒体后，4℃ 10,000g离心10分钟，弃上清留沉淀。
23.重复上步操作，最后得到无基因组DNA污染的线粒体沉淀。四：线粒体DNA提取
24.在线粒体沉淀中加入600uL预热的细胞器DNA纯化溶液A到线粒体沉淀中，充分吹打均匀。
25.再加入300uL预热的细胞器DNA纯化溶液B到离心管中（此溶液粘稠，需要预热到65℃取用），颠倒数次混匀。此时溶液中可能有白色丝状悬浮物产生。
26.65℃放置5分钟。
27.加入200uL自备氯仿，震荡混匀10-30秒，此时溶液将呈乳白色。
28.12,000g室温离心2分钟。此时上清液将变得透明，中间层有白膜。小心转移上清液到一个新的1.5mL塑料离心管中，避免触及中间的白膜。
29.加入1.5倍体积的细胞器DNA纯化溶液C，颠倒混匀后转移到离心吸附柱中，静置2分钟。
30.12,000g室温离心1分钟，弃收集管中的穿透液。
31.将0.5mL通用洗柱液加入离心柱中，12,000g室温离心1分钟，弃穿透液。
32.重复上步操作一次。
33.空甩半分钟去除残留液体，将离心吸附柱转移到新的1.5mL离心管中。
34.加30-50uLDNA洗脱液2.0，室温放置3-5分钟。
35.12,000g室温离心1分钟即得纯化的mtDNA溶液，立即使用或放-20℃长期保存。