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文献和实验
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库存 :54
英文名 :BaiScript Ⅱ RT Kit
保质期 :一年
供应商 :北京百奥莱博科技有限公司
保存条件 :-20℃
规格 :25次|100次
特别提示:包括cDNA第一链合成试剂盒(改良M-MLV)在内,本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
产品名称:cDNA第一链合成试剂盒(改良M-MLV)
英文名称:BaiScript Ⅱ RT Kit
产品货号:WH0099
产品规格:25次|100次
本试剂盒适用于二级结构复杂和长链cDNA合成。提供了所有的用于cDNA第一链合成的试剂,其中的BaiScriptⅡ RTase为改良后的莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶(M-MLV),改良后的新RTase具有更高的模板亲和力和更低的RNase H活性,因此使其在cDNA第一条链的合成过程中具有通读复杂二级结构模板和反转录长片段cDNA的能力。产品中配备的5×BaiScriptⅡ RTase Buffer经过精心的优化,既保证了新型RTase的高效酶活,又拓宽了RNA模板量的加入范围,使得反转录出来的cDNA具有更好的质量以便用于后续的实验分析。
产品特点:
·酶活效率高:高效的反转录酶活性,后续实验兼容性好。
·底物范围广:适用于所有RNA,尤其是具有复杂二级结构的RNA模板。
·反转片段长:cDNA第一链合成可以达到12 kb。
产品应用:
· cDNA第一链的合成;
· cDNA文库的构建;
·一步法RT-PCR;
· RACE分析。
使用实例:
本试剂盒对不同长度片段的反转录能力
实验材料:人类贴壁细胞总RNA。RT-PCR起始量:20μl反转录产物(50ng/μl)
实验结果:以上为1μg总RNA反转录后取2μl反转录产物进行10个长度不同的目标基因的扩增图
扩增体系:20μl
上样量:5μl
电泳条件:6V/cm,20min
各泳道图示:
1:产物长度120bp;2:产物长度1.0kb
3:产物长度2.5kb;4:产物长度3.2kb
5:产物长度4.6kb;6:产物长度6.8kb
7:产物长度7.6kb;8:产物长度8.9kb
9:产物长度10 kb;9:产物长度12 kb
试剂盒组成:
组分 | 25次 | 100次 |
BaiScript II RTase (200U/μl) | 25μl | 100 μl |
Oligo (dT)15(10μM) | 60 μl | 240 μl |
Random (10μM) | 60 μl | 240 μl |
5×BaiScript II RTase Buffer | 150 μl | 500 μl |
RNase-free ddH2O | 1ml | 2×1ml |
Super Pure dNTPs (10mM,each) | 30 μl | 120 μl |
RNasin (40 U/μl) | 15 μl | 2×30 μl |
储存条件:-20℃可保存一年。
注意事项:请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1.用于cDNA合成反应的溶液试剂尽可能用DEPC进行处理,并在高压灭菌后使用。有些试剂不能高压灭菌时,首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后,再将溶液进行滤除菌处理。
2.RNA样品要避免基因组DNA污染;
3.避免反复冻融RNA,使RNA保持在冰浴中处融化状态;
4.试剂盒中各组分成分应在-20℃保存;
5.在使用Random Primer时,要注意随机引物量和总RNA量之间的关系,一般建议50ng随机引物/5μg总RNA。当提高Random/RNA的比率将会提高短片段(~500 bp)cDNA的合成;而当降低Random/RNA的比率将会提高长片段cDNA的合成;
6.如果模板RNA富含二级结构,可以先在65℃条件下处理5min;
7.如果反转录中使用PCR下游引物,为了防止引物错配导致的非特异扩增,可以在50℃条件下进行反转录;
8.在进行长片段扩增时,为了防止cDNA结果被破坏,建议以70℃下处理15min为酶灭活条件;
9.当使用酶类时,应轻轻混匀,避免起泡;分取之前要小心地离心收集到反应管底部,由于酶粘度高,吸取时应慢慢吸取。
10.如果要扩增长片段,需使用新鲜提取所得的完整性好、纯度高的RNA。
操作步骤:
1.将模板RNA在冰上解冻;引物、5×BaiScriptⅡRTase Buffer、Super Pure dNTPs混合液和RNase-free ddH2O在室温(15-25℃)条件下解冻,解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀,简短离心以收集残留在管壁的液体。
2.按照下表的体系在冰浴的无核酸酶的离心管中配制混合液:
表1:gDNA去除反应体系
加入物 | 加入量 |
RNA | 1 ng~2μg Total RNA 或1pg~2 ng Poly(A) mRNA |
Primer | 2 μl Oligo-dT(10μM) 或2 μl Random Primer(10μM) 或10~15 pmole基因特异性引物 |
Super Pure dNTPs (10mM) | 1 μl |
RNase free H2O | 补充至14.5 μl |
3.65℃孵育5 min,然后置于冰上2 min。
4.在上述反应液的基础上继续加入下表所列的反转录组分:
加入物 | 加入量 |
上述反应液 | 14.5μl |
5×BaiScriptⅡRTase Buffer | 4μl |
RNasin (40 U/μl) | 0.5μl |
BaiScriptⅡRTase(200U/μl) | 1μl |
5.如果引物为Random Primer则需将体系现在25℃下孵育10 min,如果引物为Oligo-dT和基因特异性引物则不需要此步骤。
6.42℃孵育60 min。
7.85℃加热5 min(或70℃加热15min)终止反应,置于冰上进行后续实验或冷冻保存。
除了cDNA第一链合成试剂盒(改良M-MLV),,我公司还供应以下相关产品:
货号 | 名称 | 规格 |
ZN0052 | alpha-synuclein mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
ZN0091 | Aromatase mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
ZN0112 | AXIN2 mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
ZN0199 | Caspase-8 mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
ZN0216 | CBP/P300 mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
ZN0512 | FGF9 mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
ZN0669 | HOTAIR mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
ZN0684 | HSP105 mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
ZN0750 | Integrin-α3/ITGA3 mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
ZN0781 | Interleukin 4Rα/IL-4Rα mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
ZN0844 | LFABP mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
ZN1061 | P130 mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
ZN1402 | TLR15 mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
ZN1407 | TLR8 mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
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