cDNA文库构建

提供商 ：天津科斯莫生物技术有限公司

服务名称 ：cDNA文库构建

cDNA文库构建
概述：
cDNA文库的构建是功能基因组研究的一种经济、快速、有效的途径，它为基因克隆、芯片制备、功能基因筛选等研究打下重要基础。天津科斯莫生物采用SMART实验策略实现cDNA文库的构建,服务涉及RNA抽提、mRNA纯化、RT-PCR、同源重组、转化、文库评价等。
 
技术原理及背景：
常规的建库需要在合成的cDNA双链两端通过连接加上相同或者不同的adaptor，用相应的酶切后可以插入载体中。由于连接效率低往往导致低丰度或者是较长的cDNA信息的丢失，使文库偏重高丰度和较短的基因，失去应有的代表性。在做表达文库时，如果cDNA的两端是同一个酶切位点，由于cDNA可能按两个不同的方向接入载体，反向接入载体的那些cDNA不能正确表达，因而有50%的可能丢失。然而用两个不同的Adaptor又会涉及双酶切以及双酶切是否完全的问题，影响产率。另外由于表达时3个碱基代表一个氨基酸，不同的表达框架会得到不同的产物，因此正向插入一个表达载体的cDNA只有1/3的可能得到正确的产物。虽然一度有ABC表达载体的解决方法，但是一段DNA同时插入3个载体的机会是有限的。
利用SMART技术建库，可以得到全长的cDNA文库，也不需要Adaptor的连接。这个试剂盒的SMART引物和CDS引物与前面的试剂盒略有不同，分别带有一个不完全相同的SfiI酶切位点。SfiI是一个在真核生物中极为稀少的酶，出现的频率要远远小于NotI、EcoRI等识别6个碱基位点的酶。SfiI识别序列为GGCCNNNN^NGGCC，中间的5个碱基为任意序列。因而两个引物分别带有一个不完全相同的SfiI位点就是说两个位点的中间5个碱基不同。这样经过SMART技术合成两端分别带有SMART引物和CDS引物的cDNA经过扩增后用SfiI单酶切，得到的是两端的粘端不同的cDNA，这样就可以定向插入特定的载体中，不会浪费50%的信息。
SMART技术的出现是一个新的里程碑。这个称作Switching Mechanism At 5’end of the RNA Transcript(SMART)，原理实际上非常简单：在合成cDNA的反应中事先加入的  3’末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到 达mRNA的5’末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成 的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo（dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利 用通用引物进行扩增。由于有5’帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDN A，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。
 
基本步骤：
1. mRNA的提纯，获得高质量的mRNA；
2. cDNA第一条链的合成；
3. cDNA第二条链的合成；
4. 双链cDNA的修饰；
5. 双链cDNA的分子克隆；
6. cDNA文库的扩增；
7. cDNA文库鉴定评价。

最终结果：
1. 产物电泳图谱；
2. 初始库；
3. 文库评价数据，包括库容量，插入片段平均长度，重组效率, cDNA完整性评价等。

注意事项：
样品需求量：组织（2～3克），细胞（10⁸）,总RNA(200 ug)，mRNA(5～10 ug)，请务必保持样品新鲜，RNA无任何降解，以确保文库质量，请尽量提供物种基因组背景资料信息，如：基因组大小，基因平均长度等等。