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文献和实验
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英文名 :Annexin V-Alexa Fluor 647/PI
CAS号 :BL10003
保质期 :201904
供应商 :上海帛龙生物科技有限公司
保存条件 :4℃
规格 :20 assays
Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 细胞凋亡检测试剂盒目 录 号 | 规 格 |
BL10003-020 | 20 assays |
BL10003-050 | 50 assays |
BL10003-100 | 100 assays |
产品介绍:
磷脂酰丝氨酸(PS)是一种带负电荷的磷脂,正常细胞中,PS只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜 PS由脂膜内侧翻向细胞膜外侧,使PS暴露在细胞膜外表面。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被公认为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
将Annexin V进行红色荧光Alexa Fluor 647标记,以标记了的Annexin V作为探针,利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜,但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此采用Annexin V与PI双染的方法,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。在双变量流式细胞仪的散点图上,左下象限显示活细胞,右下象限为早期凋亡细胞,右上象限是凋亡晚期细胞和坏死细胞。
试剂盒组份:
组份 | 20 assays | 50 assays | 100 assays | 保存条件 |
Annexin V-Alexa Fluor 647 | 100 μl | 250 μl | 500 μl | 4oC避光 |
Propidium Iodide, PI | 200 μl | 500 μl | 1000 μl | 4oC避光 |
Binding Buffer ( 4´ ) | 4 ml | 10 ml | 20 ml | 4oC |
所需实验器材:
- 微量移液器
- PBS
- 不含EDTA的胰酶消化液
- 低速离心机
- 流式细胞仪
注意事项:
- 此试剂盒仅供研究使用。
- 微量试剂需离心数秒将试剂收集至管底后再开盖取用。
- Propidium Iodide(PI)有毒,操作时要带手套,使用时避免与皮肤,眼睛和黏膜接触。
- Annexin V-Alexa Fluor 647中含有剧毒成分NaN3, 操作时要带手套,使用时避免与皮肤,眼睛和黏膜接触。
- 本试剂盒用于检测活细胞,流式细胞仪检测时,细胞数量不应低于1x106。
- 染色后宜尽快检测,时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。
- Annixin V检测凋亡细胞的方法适用于悬浮生长的细胞,如:淋巴细胞等细胞的检测。对于贴壁生长的细胞,由于在胰酶等消化处理过程中会造成细胞膜的损伤,会造成较高的假阳性,而用细胞刮子会造成细胞粘连成团,而影响检测,可将胰酶消化后的细胞保存在含2%BSA的PBS中,防止进一步的损伤。尽管目前,包括国外也有一些单位采用该方法检测贴壁生长的细胞。我不推荐用该方法检测。因为其重复性较差,且需要操作时非常小心。
- 消化贴壁细胞残留的胰酶会消化并降解Annexin V-Alexa Fluor 647,最终导致染色失败。
- 细胞固定后可能导致荧光的淬灭,请不要固定样品。
操作说明:
- 细胞样品的准备:
- 悬浮细胞:
- 收集细胞至离心管中1000-2000rpm离心5min,小心去除上清。
- 用1ml 4℃预冷PBS轻轻重悬细胞并计数,1000-2000rpm离心5min,小心吸除上清。
- 再加入1ml 4℃预冷的PBS重悬细胞,1000-2000rpm离心5min,小心吸除上清。
- 悬浮细胞:
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- 贴壁细胞:
- 吸出细胞培养液至离心管中,PBS洗涤贴壁细胞一次,加入适量不含EDTA的胰酶细胞消化液消化细胞。
- 室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时,吸除胰酶细胞消化液。需避
- 贴壁细胞:
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- 加入步骤i中收集的细胞培养液,稍混匀,转移到离心管内,1000-2000rpm离心5min,小心吸除上清。
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- 用1ml 4℃预冷PBS轻轻重悬细胞并计数,1000-2000rpm离心5min,小心吸除上清。
- 再加入1ml 4℃预冷的PBS重悬细胞,1000-2000rpm离心5min,小心吸除上清。
-
- 用去离子水按1:4稀释Binding Buffer(4ml Binding Buffer+12ml去离子水);
- 用250ml结合缓冲液重新悬浮细胞,调节其浓度为1×106/ml;
- 取100ml的细胞悬液于5 ml流式管中,加入Annexin V- Alexa Fluor 647,轻轻混匀;
- 室温(20-25oC)避光孵育10min;
- 上机前5min加入10ml 碘化丙啶溶液,轻轻混匀;
- 上机前在反应管中补加400ml PBS重悬细胞, 避光保存, 随即进行流式细胞仪(FACS)检测, Annexin V- Alexa Fluor 647和PI均为红色荧光。
参考文献:
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