Y2HGold酵母感受态细胞

库存 ：366

英文名 ：Y2HGold Chemically Competent Cell

保质期 ：三个月

供应商 ：北京百奥莱博科技有限公司

保存条件 ：-80℃

规格 ：10×100μl/50×100μl

特别提示：包括Y2HGold酵母感受态细胞在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：Y2HGold酵母感受态细胞
英文名称：Y2HGold Chemically Competent Cell
产品货号：MQ0064
产品规格：10×100μl/50×100μl

Y2HGold菌株是GAL4系统酵母双杂实验用菌株，MATa型，可直接转化质粒或与MATα型酵母菌株Y187通过mating操作进行蛋白互作验证或筛库试验。
Transformation marker为：trp1，leu2，报告基因为：AbAr，HIS3，ADE2，MEL1。
Y2HGold-GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：PGBKT7和PGADT7。
质粒PGBKT7的筛选标志为TRP1，用于表达DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N端1~ 174位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白；质粒PGADT7的筛选标志为LEU，用于表达AD(GAL4 C端768 ~881位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。
GAL4系统原理：一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域：位于N端1 ~174位氨基酸区段的DNA结合域(DNA-BD)和位于C端768 ~881位氨基酸区段的转录激活域(AD)。
DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并与之结合。
而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的GAL4活性，使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下，BD不与AD结合，将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合，形成bait融合蛋白(bait-BD)和prey融合蛋白(prey-AD)，如果bait和prey发生相互作用，就会促使BD和AD的相互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。
Y2HGold有四个报告基因：AbAr，HIS3，ADE2，MEL1，分别由三种不同的启动子(G1，G2，M1)启动，这三种启动子只有GAL4识别的17bp核心区相同，其余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。此外新报告基因AbAr与以前的营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点，也可以降低酵母双杂假阳性发生的概率。Y2HGold感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，经PGADT7质粒检测转化效率>104cfu/μg DNA。
保存条件：-80℃
基因型：
MATa，trp1-901，leu2-3，112，ura3-52，his3-200，gal4Δ，gal80Δ,LYS2：：GAL1UAS–Gal1TATA–His3，GAL2UAS–Gal2TATA–Ade2 URA3：：MEL1UAS–Mel1TATA AUR1-C MEL1
操作说明：
1.取100μl冰上融化的Y2HGold感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5μg，Carrier DNA(95-100度5min,快速冰浴，重复一次)10 μl，PEG/LiAc 500μl并吸打几次混匀，30度水浴30分钟(15 min时翻转6-8次混匀)。
2.将管放42度水浴15min(7.5 min时翻转6-8次混匀)。
3.5000 rpm离心40s弃上清，ddH2O 400μl重悬，离心30s弃上清。
4.ddH2O 50μl重悬，涂板,29℃培养48-96h。
注意事项：
1.感受态细胞最好在冰上融化。
2.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3.同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
4.Y2HGold酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
5.菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，Y2HGold的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole(AIR)在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6.酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48h培养可见直径1mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60h培养可见直径1mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80h培养可见直径1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1mm克隆。

除了Y2HGold酵母感受态细胞,，我公司还供应以下相关产品：



名称：酿酒酵母NMY51感受态细胞
货号：BTN140388
规格：10×100μL
 NMY51感受态细胞是膜系统酵母双杂宿主菌，本产品经PGADT7质粒检测转化效率为104cfu/μg DNA 。

基因型：MAT a his 3Δ200 trp 1-901 leu 2-3,112 ade 2 LYS2::(lex Aop)4-HIS 3 ura 3::(lex Aop)8-lac Z ade 2::(lex Aop)8-ADE 2 GAL 4

储存条件：干冰运输，-80℃保存，有效期6个月。

名称：硫酸链霉素溶液
货号：BTN60210
规格：10mL
本产品为50mg/mL的硫酸链霉素溶液，可以加入到细菌液体或固体培养基中培养含抗性基因的细菌。1943年美国 S.A.瓦克斯曼从链霉菌中析离得到，是继青霉素后第二个生产并用于临床的抗生素。它的抗结核杆菌的特效作用，开创了结核病治疗的新纪元。

作用原理：高浓度的链霉素主要与细菌核糖体30S亚单位的S12结合，阻止甲硫氨酸-tRNA与核糖体30S亚单位结合，从而抑制蛋白质合成的启动。低浓度时，链霉素导致mRNA的错读。

抗性机制：抗性基因str特异性表达一种蛋白酶，可修饰链霉素，抑制其与核糖体结合。

储存条件：低温运输，4℃避光保存，有效期6个月。

名称：Gateway entry clone构建试剂盒
货号：ALH328
规格：20次
本试剂盒采用了世界最*进的定向拓扑异构酶克隆技术可以在5分钟内将待表达目的基因（高保真酶扩增的平末端片段）一步法定向克隆到Gateway入门载体，得到的入门克隆可以和各种Gateway目的载体通过LR重组反应，生成表达克隆。方便目的基因在原核/哺乳动物细胞/酵母/昆虫表达系统切换表达。

试剂盒组份：
Gateway入门载体(30ng/μl)—————20μl
10×Enhancer-———————————20μl

产品特点：
1. 简单快速，加入待表达基因片段室温仅需5分钟便可完成入门克隆构建。
2. 定向克隆技术，超过90%插入为正确方向插入，减少克隆筛选耗费的时间。
3. 构建的入门克隆不含原核表达Shine-Dalgarno（SD)序列，因此构建原核表达克隆时应选择带SD序列的目的载体进行Gateway LR重组。

储存条件：-20℃，有效期12个月。

本制品别名：Gateway入门克隆构建试剂盒

名称：通用型T载体克隆菌落PCR检测试剂盒
货号：ALH351
规格：80次|400次
本试剂盒采用通用T载体引物研制的通用T载体菌落PCR鉴定试剂盒，只需购买一种试剂盒，便可用于市面上所有常见的T载体(包括pGEM，pUC，pBluescript系列) 连接阳性克隆的鉴定。此外，采用T3,T7或者SP6做引物的菌落PCR鉴定试剂盒引物距离插入位点的距离非常短，因此在鉴定100bp左右或者更小片段的插入时，阴性克隆的引物二聚体条带和阳性克隆扩增条带大小接近，无法区分。往往把引物二聚体的条带看成是阳性扩增条带，造成假阳性。反之，造成假阴性。本试剂盒通用T载体引物在未插入片段时的距离至少有150bp以上，加上插入片段的长度，可以清晰的区分是插入片段扩增出的条带还是引物二聚体扩增出的条带。避免假阳性或者假阴性，大大提高了准确性。本公司研发的一管便携式PCR MasterMix预混系统，无需您一一加入各种成分，直接加入需筛选单菌落，经过1小时左右的PCR反应和电泳检测即可得到重组菌落鉴定的结果。

试剂盒组份(400次)：
2 × Taq PCR MasterMix——————5ml
Universal primer F————————250μl
Universal primer R————————250μl
ddH2O———————————————5ml

注意事项：
1. 重组菌落鉴定时，挑取单菌落前，应先做好标记，便于鉴定后使用。
2. 挑取菌落时，应选择单菌落，不要挑取太多菌体，以免影响PCR 结果。
3. 设定PCR 程序时，请根据插入片段大小决定延伸时间，如果插入片段大小为1 kb以下，延伸时间30-45 秒即可，如果片段更长，可按此比例增加延伸时间。

储存条件：-20℃。

本制品别名：T载体阳性克隆检测试剂盒

名称：硫酸卡那霉素
货号：SY0288
规格：10g
硫酸卡那霉素（Kanamycin sulfate）是一种氨基糖苷类抗生素，对革兰氏阳性菌和阴性菌及支原体都有抑制作用。作用机制在于靶向结合细菌70S核糖体亚基，从而抑制核糖体易位和引起错误编码进一步干扰蛋白质合成。硫酸卡那霉素可用在细胞培养中抑制细菌污染。分子生物学研究中，它常用来选择性筛选成功转化卡那霉素抗性基因（kan gene）的细菌克隆；也常用于农杆菌介导的转化实验，选择性筛选携带npt II（APH3）基因的植物组织。本品达到USP级别，易溶于水（50 mg/ml），需过滤除菌后使用，推荐工作浓度为30-50 µg/ml。

名称：DB3.1化学感受态细胞
货号：MQ0010
规格：10×100μl/50×100μl
DB3.1大肠杆菌菌株基因组中含有gyrA462基因，赋予其对ccdB毒性基因的抗性，特别适用于构建或扩繁含有ccdB基因的质粒载体(例GATEWAY System vector)，此菌株具有链霉素抗性。
DB3.1感受态细胞经特殊工艺制作，经pUC19检测转化效率>108 cfu/μg DNA。
保存条件：-80℃
基因型：
F-gyrA462 endA1 glnV44(sr1-recA)mcrBmrrhsdS20(rB-,mB-)ara14galK2lacY1proA2rpsL20(Smr)xyl5 Δleu mtl1
操作说明：
1.DB3.1感受态细胞放置冰中融化(或放手心或室温片刻，待菌体处于冰水混合状态时迅速插入冰中)，加入目的DNA并用指尖轻轻拨打管底混匀(避免用枪吸打)，冰上静置25分钟。
2.42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3.向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基(2YT或LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。
4.5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。
5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
注意事项：
1.感受态细胞最好在冰上融化。
2.混入目的DNA时应轻柔操作。

名称：酵母化学感受态细胞制备试剂盒
货号：BTN81109
规格：20次

名称：DH5a感受态细胞
货号：MT0062
规格：10×100μl
大肠杆菌经Ca离子处理后可摄取外源DNA(Plasmid、Phage DNA)，处于这种状态的细胞称作感受态细胞。在进行基因重组时，使用感受态细胞的转化实验应用十分广泛。制作基因文库、重组质粒体以及进行亚克隆实验时，特别是目的基因含量十分低的情况下时，使用高效的感受态细胞十分重要。使用pUC57质粒检测该DH5a感受态细胞，转化效率可达10⁷～10⁸。在-70℃下保存数月转化效率不发生明显降低。

操作方法：
1．取出感受态细胞，置于冰上5分钟，解冻。
2．向感受态细胞中加入1～10μl连接产物，轻弹离心管底部混匀，冰上放置30 min。
3．置于42℃热激60s后，迅速置于冰上急冷2分钟。
4．向热激完毕的感受态细胞中，加入700μl经37℃预热的LB(或SOC)培养基(不含抗生素)，37℃振荡（225 rpm）培养1小时。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
5．室温4,000 rpm离心5分钟，弃去700μl上清后，用剩余100μl培养基重悬细胞并涂布到含相应抗生素的LB琼脂平板表面。
6．将平板置于37℃培养，12～14小时后可出现菌落。

注意事项：
1. 感受态细胞应保存在-70℃，不可多次冻融和放置时间过长，以避免降低感受态细胞的转化效率。
2. 所有操作均需注意无菌操作。
3. pUC18 plasmid 标准品（0.2ng/μl），含有氨苄青霉素抗性，作为阳性对照使用，每次转化5μl，可以得到约100～1000个克隆。

常见问题分析：

问题：转化具有氨苄青霉素抗性的平板出现卫星菌落
原因分析：有些载体带有β-内酰胺酶的基因，表达出β-内酰胺酶，它可以破坏氨苄青霉素。当细菌培养时间过长，β-内酰胺酶积累过多，就会使氨卞青霉素失效，导致不含质粒的空菌落大量生长，这就是卫星菌落。由于生长时间较短，故卫星菌落一般较小，星状分布，环绕在中心菌落周围，卫星菌落由此得名。在克隆过程中挑取中心的大的克隆子一般对结果不会有什么影响。
解决方法：
（1）通常氨苄青霉素抗性的平板推荐使用浓度为200ug/ml；
（2）培养时间通常12个小时即可看到阳性克隆，培养超过16h后，易出现卫星菌落，如出现卫星菌落挑取中心大克隆，不影响实验结果。

储存条件：-80℃可保存一年。