NutriStem® V9 XF Medium多能干细胞无血清培养基

细胞类型 ：hPSC，ES，iPS

供应商 ：上海逍鹏生物科技有限公司

规格 ：500ml

1 目的：利用含玻璃粘连蛋白V9干细胞无血清培养基，长时间培养人类多能干细胞 (hPSC)支持细胞增生并且维持细胞多能性。
* 人类多能干细胞 (hPSC) 包含人类胚胎干细胞 (hESC) 及人类诱导多能干细胞 (hiPSC)。
2 材料：人类多能干细胞 (hPSC)。
3 主要仪器：生物安全柜，CO2培养箱，6孔培养盘。
4 试剂：

表1：建议选用试剂

品牌	货号	名称	规格	保存条件
Biological Industries	05-105-1A	NutriStem® V9 XF Basal Medium V9多能干细胞无血清基础培养基	500ml	-20℃
Biological Industries	05-106-1F	NutriStem® V9 XF Supplement Mix V9多能干细胞无血清添加剂	1 ml	-20℃
Biological Industries	05-754-002	Vitronectin ACF 玻璃粘连蛋白（无动物源成分）	200 μg	-20℃
Biological Industries	01-862-1B	0.5M EDTA Solution 0.5M EDTA溶液	100 ml	常温
Biological Industries	02-023-1A	DPBS (w/o Ca & Mg) DPBS缓冲液	500ml	常温
Biological Industries	05-710-1B	CryoStem™ hPSC Freezing Medium  hPSC无血清冻存液	500ml	4℃

5 实验前准备及使用说明
5.1 制备NutriStem® V9 XF Medium
5.1.1 在2-8°C或室温下解冻NutriStem® V9 XF基础培养基，在冰上解冻NutriStem® V9 XF无血清添加剂；建议不要在37°C下解冻产品。
5.1.2 将1ml NutriStem® V9 XF无血清添加剂，加入到500ml基础培养基中，并旋转混合瓶子，并避光保存。
5.1.3 制备完成的NutriStem® V9 XF Medium储存在2-8°C，2周内使用完毕。
5.1.4 使用前，请将NutriStem® V9 XF Medium加热至室温（15-30°C），为了确保介质的稳定性，只需加热所需的量。

5.2 制备0.5mg / ml玻璃粘连蛋白 (Vitronectin)

5.2.1 在冰上解冻玻璃粘连蛋白, 作为预包被试剂，或使用其他品牌产品。(玻璃粘连蛋白是一种冻干蛋白，应储存在-10°C至-20°C)。
5.2.2 使用前先离心，在原来的0.2mg小瓶中加入0.4ml组织培养等级无菌水，并在冰上孵育2-5分钟；过程中请勿震荡。 
5.2.3 轻轻上下晃动使试剂混匀。
5.2.4 置于冰上备用（2-8°C储存可达1周）。
5.2.5 若需长期保存，请分装并冷冻在-20℃，不建议反复冻融。

5.3 制备玻璃粘连蛋白预包被培养盘 (0.5μg/ cm2)
以浓度0.5μg/ cm2玻璃粘连蛋白，包被10cm2 /孔（6孔组织培养盘中的每孔）；0.5μg/ cm2玻璃粘连蛋白适用于大多数hPSC细胞株。
 
5.3.1 在冰上解冻玻璃粘连蛋白。
5.3.2 以2ml无钙/镁DPBS稀释10μl 0.5mg / ml玻璃粘连蛋白。
5.3.3 将2ml稀释的玻璃粘连蛋白，加入到6孔盘的每个孔中，在室温孵化一个小時。(其他培养器皿包被建议体积，请参考下表2)
* 包被培养盘可2-8℃无菌储存7天，需用石腊膜（例如Parafilm®）密封培养盘防止水分蒸发。
* 请在使用前，将培养盘预热至室温，用无钙/镁DPBS润洗孔盘一次，并每孔加入3ml NutriStem® V9 XF Medium。
5.3.4 立即使用，吸弃玻璃粘连蛋白，不要让盘子干燥。
5.3.5 立即用2ml无钙/镁DPBS清洗培养盘一次。
5.3.6 加入3ml NutriStem® V9 XF Medium。

表2：玻璃粘连蛋白包被建议体积

培养器皿	表面积 (cm2)	0.5mg/ml玻璃粘连蛋白以0.5μg/ cm2包被	无钙/镁DPBS
24孔盘	2	2μl	0.4ml
12孔盘	4	4μl	0.8ml
6孔盘/ 35 cm培养盘	10	10μl	2ml

* 包被培养盘可2℃-8℃储存，需在一周内使用。
* 包被期间，注意请勿让包被液干掉！

5.4 无预包被培养操作说明
玻璃粘连蛋白直接加入NutriStem® V9 XF Medium，即可接种hPSC细胞。玻璃粘连蛋白添加浓度为0.25-0.375μg/ cm2 (无需预包被，可节省25-50%的玻璃粘连蛋白使用量，下表3)。 
表3：0.5mg/ml玻璃粘连蛋白液在不同操作方式中的使用量
(培养器皿：6孔组织培养盘)
 

预包被	玻璃粘连蛋白使用浓度	0.5µg/ cm2
	玻璃粘连蛋白需要量	10μl
无预包被	玻璃粘连蛋白使用浓度	0.25-0.375µg/ cm2
	3ml培养基中需要添加的玻璃粘连蛋白量	5-7.5µl

5.5 无包被培养操作范例
使用浓度为0.5mg/ml的玻璃粘连蛋白，于10cm2（6孔组织培养盘的每个孔盘中）中培养hPSC细胞。
5.5.1 在冰上解冻玻璃粘连蛋白。
5.5.2 在6孔组织培养盘的每孔中，加入3ml NutriStem® V9 XF Medium。
5.5.3 每孔中加入5-7.5μl玻璃粘连蛋白。（也可以先添加玻璃粘连蛋白至NutriStem® V9 XF Medium，再将含玻璃粘连蛋白培养基加入培养盘中）
5.5.4 在37℃、5% CO2培养箱，孵育至少30分钟。

6 无酵素细胞传代操作程序
hPSC细胞通常每4-5天传代一次，细胞培养密度关乎維持未分化的hPSC细胞健康生长，高细胞融合度可能导致细胞分化。传代的时间，应由集落大小和密度決定，而不是孔盘中的集落数。
以下一种或多种情况时，细胞需进行传代：
1) hPSC集落变得太密集。
2) hPSC集落变得太大。
3) 细胞覆盖培养容器表面积大约80％。
4) 细胞分化比率达15 %。
如果细胞太密集或太稀疏，应调整细胞接种比率；如果hPSC融合度达70%，应在24小时内进行细胞传代。

6.1 细胞传代前准备
6.1.1 0.5mM EDTA 分离溶液配置：50μL的0.5M EDTA与50ml无钙/镁离子DPBS混匀后无菌过滤即可使用；室温可储存6个月。
6.1.2 准备玻璃粘连蛋白预包被培养盘：6孔组织培养盘用无钙/镁离子DPBS洗一次，每孔加3ml NutriStem® V9 XF Medium，并在37℃、5% CO2培养箱，孵育至少30分钟。

6.2 无酵素传代步骤
此方法用于hPSC小团块传代方式，以面积为10cm2 /孔的6孔组织培养盘为例。
6.2.1 用2ml无钙/镁离子DPBS润洗两次。
6.2.2 加入1ml 0.5mM EDTA溶液，旋转孔盘以覆盖整个细胞表面，并迅速吸出 (此步骤为移除培养环境中的钙和镁离子，避免影响后续EDTA分离细胞效果)。
6.2.3 加入1ml 0.5mM EDTA，在室温或37℃孵育4-5分钟 （孵化时间和温度，不同细胞株会有所不同；hPSC细胞株，3-4分钟室温即可）。
6.2.4 以1ml枪头吹打细胞3-4次，让细胞集落形成小团块，谨慎将细胞团块重悬在适量NutriStem® V9 XF Medium (不要刮或过多的吹打细胞，避免形成单颗细胞悬浮)。
6.2.5 将小的细胞团块按照不同细胞株所需比例 (1:8-1:20)，转移至含3ml NutriStem® V9 XF Medium的玻璃粘连蛋白包被孔中。
6.2.6 将培养盘放入37℃、5% CO2培养箱内培养。
6.2.7 48小时后，每天更换一次2.5-3.0ml新的NutriStem® V9 XF Medium，直到hPSC细胞形成大细胞集落。(48小时内不要移动盘子，可能会使细胞分化)。

7 使用CryoStem™ hPSC冻存液，冻存hPSC细胞
    以下冻存方法适用于冻存hPSC小团块。为获得最佳冻存的细胞, 冻存前细胞应处在健康、高度未分化 (分化应少于10%) 且快速生长状态，并在细胞融合度达60-70%时进行冻存。
7.1 在6孔盘中每孔加入2ml无钙/镁离子DPBS润洗两次。
7.2 加入1ml 0.5mM EDTA溶液，旋转孔盘以覆盖整个细胞表面，并迅速吸出 (不要长時间将细胞暴露于EDTA溶液中)。
7.3 加入1ml 0.5mM EDTA，在室温或37℃孵育4-5分钟 (孵化时间和温度，不同细胞株会有所不同。hPSC细胞株，室温3-4分钟即可。)
7.4 轻轻取出EDTA溶液，小心加入1ml NutriStem® V9 XF Medium。
7.5 轻轻上下吸取吹打3-4次，谨慎将细胞小团块重悬至适量NutriStem® V9 XF Medium。
7.6 轻轻吸取细胞悬液至离心管，在室温200xg离心5分钟。
7.7 取出并弃去上清液，小心不要打散小细胞团块。轻轻拍打管底，使沉淀的细胞团块松散。
7.8 取适当体积CryoStem™ hPSC冻存液，轻轻悬浮沉淀，以每管1ml 细胞悬浮冻存到每个冻存管。
* 在6孔盘中培养达70%细胞融合度的hPSC，可冻存2-3管冻存管。
7.9 细胞冻存：将冻存管转移到冷冻容器（如Frosty）中，并放在-80°C冰箱或使用控制率冷冻设备，24小时后转入液态氮长期储存。

8 NutriStem® V9 XF Medium复苏hPSC细胞
在解冻hPSC细胞之前，确保6孔盘已包被玻璃粘连蛋白。融合度达60-70%的hPSC细胞培养6孔盘，一般会冻存至2-4个低温冻存管，并预期一管复苏至一孔的6孔盘中。
8.1 复苏hPSC细胞准备
8.1.1 准备一个新的玻璃粘连蛋白包被孔盘：确认hPSC标记平板：如细胞株，细胞代数和解冻日期。
8.1.2 将孔盘中玻璃粘连蛋白溶液抽出，加入2ml无钙/镁离子DPBS，旋转孔盘润洗整个细胞表面，并吸弃DPBS。
8.1.3 立即加入3ml NutriStem® V9 XF Medium。
8.1.4 在37℃孵育30分钟。

8.2 复苏细胞
8.2.1 在新离心管中加入9ml已预热的NutriStem® V9 XF Medium。
8.2.2 从液氮中取出hPSC冻存管。
8.2.3 将冻存管置于37°C水浴中，水面请勿淹没冻存瓶盖，防止细胞污染。当只剩下一小块冰晶时，用70％乙醇消毒擦拭整个冻存管。
8.2.4 在无菌生物安全柜内，将冻存管内容物转移至含9ml NutriStem® V9 XF Medium的离心管中，轻晃混匀细胞和培养基。
8.2.5 在室温200xg离心5分钟。
8.2.6 谨慎吸去上清液，在不要吸出细胞沉淀的状况下，尽可能移除含有DMSO的上清液。
8.2.7 加入1ml已预热NutriStem® V9 XF Medium，轻轻吸吐培养基，使沉淀的细胞团块松散。
8.2.8 慢慢将hPSC块悬浮液转移至1孔包被好的6孔盘中。
8.2.9 将孔盘放在37℃的培养箱中，轻轻前后晃动孔盘使细胞团块均匀分布整个孔盘 (请勿用旋转方式晃动孔盘，避免细胞集中孔內中央)。
8.2.10 在37℃、5％CO2培养箱中孵育2天。
8.2.11 48小时后，每天更换一次3.0ml新培养基，直到细胞形成大细胞聚落(48小时内不要移动盘子，可能会使细胞分化)。