产气荚膜梭菌核酸荧光Lamp检测试剂盒(荧光恒温扩增法)

库存 ：385

英文名 ：Clostridium perfringens LAMP Amplification Kit

保质期 ：一年

供应商 ：北京百奥莱博科技有限公司

保存条件 ：-20℃

规格 ：50次

特别提示：包括产气荚膜梭菌核酸荧光Lamp检测试剂盒(荧光恒温扩增法)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：产气荚膜梭菌核酸荧光Lamp检测试剂盒(荧光恒温扩增法)
英文名称：Clostridium perfringens LAMP Amplification Kit

产品货号：产气荚膜梭菌核酸荧光Lamp检测试剂盒(荧光恒温扩增法)
产品规格：50次

产气荚膜梭菌能引起人类食物中毒和抗生素相关性腹泻等, 广泛存在于自然界的土壤、水源及人和动物肠道中。目前根据产气荚膜梭菌产生的4 种重要的致病性毒素(α、β、ε、ι毒素)能力, 可将其分为A(α)、B(α、β、ε)、C(α、β)、D(α、ε)和E(α、ι)型, 各型产气荚膜梭菌均含有α-毒素(CPa)基因。LAMP 等温扩增（环介导等温扩增）利用4条模板专一的特异引物和具有链置换能力的DNA聚合酶，在等温条件下(63℃左右) 30-60分钟完成扩增。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于 PCR 技术，同时还不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，不依赖任何专门的仪器设备。本产品即是针对产气荚膜梭菌 CPa 基因设计的LAMP特异引物组，采用环介导等温扩增法结合荧光染料显色的体外扩增检测技术，适用于溶血性链球菌核酸的快速检测。

产品特点：
1. 高特异性，由于同时使用4-6条特异引物，所以特异性比RT-PCR更高。
2. 高扩增效率，扩增效率可达到10E9-10E10，比PCR灵敏一个数量级，可检测到单拷贝的RNA分子。
3. 65℃左右完成RT和LAMP扩增，不需要贵重的热循环仪。
4. 即开即用，包含了除引物和模板RNA外的所有成份，十分方便。
5. 肉眼检测扩增结果，不需要昂贵的电泳、荧光PCR等仪器。
6. 提供扩增对照，便于在遇到困难时分析原因。

产品组成：

组分	编号	规格
LAMP Mix（2×）	BTN11-180405a	0.5mL
Bst DNA聚合酶(8U/uL)	BTN100209	75μl
对照引物	BTN11-180405b	40μl
对照模板DNA	BTN11-180405c	5μl
25 mM MgCl2	BTN90302	0.2mL
绿如蓝染料
超纯水	BTN100935	1mL

保存条件：-20℃保存，有效期一年。

自备试剂：模板及引物

使用方法：
1. 在冰上溶解除酶外的各种组份，混匀，稍离心。在反应管中加入以下组份：

成份	样品管	阴性对照
LAMP Mix（2×）	2μl	2μl
FIP引物终浓度	0.4μl	0.4μl
BIP引物终浓度	0.4μl	0.4μl
F3引物终浓度	0.1μl	0.1μl
B3引物终浓度	0.1μl	0.1μl
Loop F引物终浓度（可选项）	0.2 uM	0.2 uM
Loop B引物终浓度（可选项）	0.2 uM	0.2 uM
10×Bst buffer	2.5μl	2.5μl
Betaine（8 mol/L）	0.4 uM	0.4 uM
MgCl2（100 mM）	1.4μl	1.4μl
自备模板DNA	1-100ng	不加
Bst DNA聚合酶(8U/uL)	1μl	1μl
补水到	25μl	25μl

混匀，置于60-65℃保温30-120分钟。注意：如果不使用Loop引物，则最好保温2小时；如果使用Loop引物，则最好保温30分钟。
2. 80℃ 10分钟灭活Bst DNA聚合酶。
3. 产物置于-20℃备用或立即用于下游检测。扩增产物可选下列方法之一检测：
1) 琼脂糖凝胶电泳。取扩增产物5μl，1-2%的琼脂糖凝胶电泳，可见LAMP特征性电泳图谱；
2) 向扩增产物中直接加入PCR级绿如蓝染料1.0μl，混匀，稍离心。将反应管置于紫外透射仪或凝胶成像系统中，紫外灯下可见绿色荧光产生；
3) 荧光定量检测。
4. 结果分析：
如果没有扩增，则需要用本试剂提供的阳性对照进行扩增。本试剂盒提供5次阳性对照，反应按下表设置：

成份	阴性对照管	阳性对照管
LAMP Mix（2×）	2μl	2μl
对照引物混合物	4μl	4μl
对照模板DNA	不加	1μl
MgCl2（25 mM）	3μl	3uL
Bst DNA聚合酶(8U/uL)	1.5μl	1.5μl
水	1.5μl	0.5μl

混匀后，置于60℃保温120分钟，其余操作同上。
注意：本对照引物中没有Loop引物，所以最好保温2小时。
如果阳性对照能够扩增出，则说明试剂盒没有问题，可能是模板或引物的问题。如果阳性对照没有扩增出条带，则是试剂盒的问题，请跟厂家联系。

注意事项：
1. 引物设计对成功扩增十分关键。除用于SNP分型外，尽量以保守区设计引物。
2. 引物至少包括F3/B3和FIP/BIP，加入环状引物F loop/B loop可以使反应速度大大提高。
3. 应优化引物序列、GC含量和尽量避免二级结构。
4. 反应中各个引物的浓度及比例对扩增效果有一定的影响。
5. 建议先将所有引物混合在一起，配制成10?浓度以方便使用。
6. LAMP扩增具有特异性好、灵敏度高、时间快、不需要特殊仪器设备等优点。但太高的灵敏度使得其比普通PCR扩增更加容易污染导致假阳性。因此，必须高度重视扩增产物的污染。常规措施包括严格的实验分区、添加UNG和dUTP（可能导致反应效率下降）、使用荧光定量等不开盖检测方法。实验室一旦遭到污染，所有相关试剂必须全部更换，必要时还得更换实验室。
7. 要确证扩增的为目标基因，可以使用特定的限制性酶切和/或Southern杂交。
8. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床治疗、食品等用途。

除了产气荚膜梭菌核酸荧光Lamp检测试剂盒(荧光恒温扩增法),，我公司还供应以下相关产品：



名称：沙门氏菌单重荧光PCR检测试剂盒
货号：SYA002
规格：48次/盒
一、简介
沙门氏菌(Salmonella)可引发人类、家畜以及野生禽兽不同形式的疾病。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。本方法为荧光PCR检测方法，反应在同一管内连续进行，操作简单，并有效防止了污染，能对样品中或预培养液中的沙门氏菌进行快速检测，具有特异性高、敏感性强和操作简便的特点。沙门氏菌的探针报告基团为FAM，淬灭基团为None。

二、用途
该试剂盒适合于增菌培养物、疑似病料及食品中沙门氏菌的检测。

三、试剂盒组成(50T/Kit)
组份 数量 规格
沙门氏菌荧光qPCR反应液(Sal-qPCR MIX) 1管 750μL/管
DNA抽提液(DNA Extraction) 2管 1.5mL/管
阴性对照(NTC) 1管 50μL/管
阳性对照(Sal-PTC) 1管 50μL/管

四、荧光PCR仪器适用范围
ABI系列，Bio-Rad系列，Roche系列等荧光定量PCR检测仪等。

五、储存条件及有效期：
本试剂盒于-18℃以下保存，有效期为6个月。

六、样品采集与DNA提取
6.1 样品采集
6.1.1 食品样品：样品的采集与预培养按照样品的采集与预培养按照《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》(GB 4789.4-2010)要求进行。
6.1.2 粪便样品：取粪便置于灭菌的收集管中送检。
6.1.3 病灶部位样品：取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血送检。
 注：上述样品建议经过增菌后，收集培养物用于检测。
6.2 DNA提取(用户可根据需要选择商业化DNA提取试剂盒)
6.2.1 培养物：取培养物50μL(培养至一定浊度)或者挑取单克隆菌落与50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。
6.2.2 粪便样品：挑取米粒大小粪便于灭菌离心管中，加入0.5mL生理盐水，振荡混匀，13000rpm离心3分钟，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
6.2.3 其他液体标本：取标本2-3mL，13000rpm离心3min，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5µL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。

七、检测步骤：
7.1 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光qPCR反应液(Sal-qPCR MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 15µL N×15µL
向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品/阴性对照(NTC)/阳性对照(Sal-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。

八、结果分析
8.1 结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
8.2 试验成立判定
（1） 阴性对照(NTC)：不应产生任何的扩增曲线。
（2） 阳性对照(Sal-PTC)：均产生扩增曲线。
（3） 以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。
8.3 结果判定
（1） 在试验成立的条件下，Ct值≤35的样本为阳性，表明Sal核酸阳性。
（2） Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明Sal核酸阴性。
（3） 如果35＜Ct值≤40，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。
（4） 对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行Sal qPCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明Sal核酸阳性；否则判为样本阴性。

九、注意事项：
（1） 初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
（2） 所有使用的离心管应高压灭菌，而且必须不含DNA酶。
（3） PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。
（4） 样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
（5） 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。