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                     microRNA研究策略

MicroRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA，几个miRNAs也可以调节同一个基因。可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。MicroRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA，长度大约为300~1000个碱基；pri-miRNA经过一次加工后，成为pre-miRNA即microRNA前体，长度大约为70~90个碱基；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20~24nt的成熟miRNA。
microRNA（以下简称mir）研究策略：
功能模型芯片筛选-QPCR验证-mir基因靶向操作-功能验证-寻找靶标与靶标蛋白内源性验证-靶标蛋白外源性luciferase-3’UTR验证-靶标回复实验（rescue实验）
一、功能模型芯片筛选：
选用有功能差异对比的样本，进行mir芯片筛选（mir-array），筛选出变化明显的mir。
现在主流的芯片平台是Agilent和Affymetrix，Agilent只检出成熟体，而Affy的芯片前体和成熟体皆检出，假阳性率较高，但Affy的容量相比Agilent的大很多。
百致生物提供Agilent和Affymetrix平台的mirarray筛选服务及后续的芯片数据分析及靶基因聚类分析。

二、芯片结果的QPCR验证：
用与1中相同的样本，对1中筛选出的mir进行QPCR验证，挑选出丰度高且变化显著的mir（以下简称mir-X）。
Mir的QPCR验证最优先选择的当然是Life的Taqman系列探针和kit，权威，但价格极其昂贵。与之相比，特定引物SYBR法检测mir价格适中，但误差率较高。
百致生物特有一步反转技术，特异性好，简单易用。百致生物已开发出针对不同种属mir的miRNA快速检测技术MiRQeasy，与市面一般的mir引物相比，信号更单一，且操作极其简便。兴拓独有MiRTeasy一步法反转录试剂，一次性转录，兼顾了专一性和通用性。

三、MicroRNA基因操作：
与mir变化相反的处理是否取缔功能表型的变化，而同向mir变化处理是否能模拟出功能表型变化。比如我们发现mir-X在细胞某种诱导分化后升高，则诱导时取缔这种升高是否会抑制分化，而单单升高该mir能否模拟出细胞分化表型。
1. 初筛选：
选取出若干芯片与QPCR验证变化一致，且组织表达丰度较高的Mir，运用Mimics（过表达）和inhibitor（封闭）分别在细胞中过表达和封闭特定的mir，观察细胞功能的变化。
注：Mimics和inhibitor表达时程很短，一般72-96小时，所以一般只作为初筛。
2. mir与Anti-mir的克隆：
Mir过表达：从miRbase上调出pri-mir序列，直接克隆pri-mir至表达载体。
Mir下调：构建mir的下调即封闭，主要的技术是sponges技术。将若干段连续mir成熟序列互补序列串联，使之在细胞内表达，吸附目标microRNA，所以称之为sponges（海绵）。
百致生物已开发并完善病毒载体介导的microRNA过表达和封闭技术平台，可针对不同的microRNA不同的实验要求为客户提供定制服务。您也可直接购买我们已经构建好的microRNA病毒颗粒或病毒载体。
3. Transgenic & Knockout
如果想考察microRNA在机体发育中的特定作用，Transgenic （TG）& Knockout （KO） mice 肯定是最好的选择。此外，斑马鱼由于其周期短，鱼身透明等特点，也为microRNA功能研究提供了很好的便利。
百致生物与各转基因研发中心有长期合作关系，并已拥有部分已构建好的microRNA TG及KO小鼠，详情可咨询百致生物销售人员。
4. 功能验证：
在目的细胞（病毒法）或者动物脏器（转基因小鼠）中高表达mir-X，观察细胞或动物的功能表型，具体功能表型依照各方向类别而不同，如细胞分化，则观察分化率等，如肿瘤，可来电来信与我们的实验技术工程师交流。
5. 寻找靶标与靶标蛋白内源性验证：
1) 靶基因的预测：生物信息学比对
目前通过生物信息学比对找出特定microRNA对应可能的靶点蛋白主要有以下几个引擎：
a． PicTar：基于microRNA或microRNA靶标联合作用等特征开发的搜寻动物的microRNA靶基因。假阳性率也较低。Rajewsky实验室开发的。网址：http://pictar.mdc-berlin.de/
b． targetScan: 基于靶mRNA序列的进化保守等特征搜寻动物的microRNA靶基因。是预测microRNA靶标假阳性率较低的软件。Bartel实验室开发的。网址：http://www.targetscan.org/
c． iRTarBase：整合实验证实的microRNA靶标的数据库。其他数据库可自行google，不一一在此列出。网址：http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/index.html
2) 表达谱芯片：
如果有条件，将样本中做mirarray同时，进行表达谱芯片分析，然后通过生物信息学预测与表达谱芯片结果交叉比对，可得出把握度大的候选靶基因。
3) 靶标蛋白的初步验证：
一般有候选的2-4个靶标蛋白为指标，应用mir基因靶向操作的细胞或组织样本进行靶标蛋白的western验证，从中找出和mir-X趋势相反且变化最明显的1-2个靶标。
4) 靶标蛋白外源性验证：  
将5中确定的靶标蛋白基因3’UTR区克隆至luciferase报告基因载体（如下图，psicheck-2，最常用的microRNA报告基因载体，promega公司产品），并与mir-X共转293T细胞，验证mir-X转入后luciferase的信号下调效率，进一步确定靶标。为了实验的严谨性，可加入靶标基因3’UTR区microRNA预测结合区域的突变体作为对照，进一步说明问题。

 
5） 靶标回复实验（rescue实验）：
一个microRNA有很多靶基因，那么在我们的模型中，我们研究的microRNA是否是通过对我们关注的靶基因的调控，起到了对功能表型的影响？为了进一步说明这个问题，靶标蛋白功能回复实验（rescue实验）的重要性不言而喻。说选做，是由于工作量大，单单做到外源性验证已经可以发表SCI paper。
Rescue实验的原理：在3的mir的基因操作模型中，一般情况下microRNA与靶蛋白都是反向变化的。即过表达mir都导致靶蛋白的下调，而封闭mir有可能导致靶蛋白的表达升高注：封闭mir导致靶蛋白升高也有很多例外，首先，可能本底该mir的表达量并不高，也不会对靶蛋白的量有太大影响；再次，microRNA对靶基因的调节都是比较温和的，而不像外源的siRNA。
方法：在过表达mir-X时，同时过表达靶标蛋白，或者在mir-X封闭的条件下，同时干扰靶标蛋白，如果我们在这个基础上，再过表达靶蛋白，如果细胞或者动物在功能上重新回归或者部分恢复到对照水平，则充分说明mir-X是通过或部分通过该靶蛋白通路，影响了功能表型。
注：生物体内上下游信号通路错综复杂，很难只改变一种因素就把生物体回归到正常，所以部分恢复也是很有意义的。

Reference
1.    Lagendijk AK, Goumans MJ, Burkhard SB, Bakkers J. MicroRNA-23 Restricts Cardiac Valve Formation by Inhibiting Has2 and Extracellular Hyaluronic Acid Production. Circ.Res. 2011;109:649-657.
2.    Aranha MM, Santos DM, Sola S, Steer CJ, Rodrigues CM. miR-34a Regulates Mouse Neural Stem Cell Differentiation. PLoS.One. 2011;6:e21396.
3.    Schraivogel D, Weinmann L, Beier D et al. CAMTA1 is a novel tumour suppressor regulated by miR-9/9(*) in glioblastoma stem cells. EMBO J. 2011
4.    Cao Q, Mani RS, Ateeq B et al. Coordinated Regulation of Polycomb Group Complexes through microRNAs in Cancer. Cancer Cell 2011;20:187-199.