产品详情
文献和实验
相关推荐
库存 :496
英文名 :NGS Fast DNA Library Prep Set for Illumina
保质期 :长期
供应商 :北京百奥莱博科技有限公司
保存条件 :-20℃
特别提示:包括二代测序DNA快速建库试剂盒(Illumina平台)在内,本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
产品名称:二代测序DNA快速建库试剂盒(Illumina平台)
英文名称:NGS Fast DNA Library Prep Set for Illumina
产品规格:24次|96次
本试剂盒提供了DNA文库构建所需要的酶预混体系及反应缓冲液,包含除接头与PCR引物外的所有成分,用于illumina二代测序平台DNA文库构建。和一般建库方法相比,该试剂盒操作简单、方便,极大地缩短了文库构建时间。另外,试剂盒采用高保真DNA聚合酶进行文库富集,无偏好的PCR扩增,扩大了序列的覆盖区域,可高效制备用于illumina二代测序平台的DNA文库。试剂盒中提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证,最大程度上保证了文库构建的稳定性。
试剂盒组成:
组份 | 24次 | 96次 |
End Prep Enzyme Mix | 48μl | 192μl |
10x End Repair Reaction Buffer | 200μl | 800μl |
T4 DNA ligase | 48μl | 192μl |
T4 DNA ligase Buffer | 400μl | 2×800μl |
HiFidelity 2×PCRMasterMix | 600μl | 2×1.2ml |
试剂盒特点;
1、末端补平,磷酸化,加A一步完成。
2、不需纯化,直接加接头。
3、超保真扩增,最大程度上降低了扩增偏好性。
4、支持多种样本,且所得文库能够用于Illumina GAIIx,HiSacnSQ、HiSeq 2500/2000/1000和MiSeq sequencing等测序平台的测序。
自备仪器、试剂和耗材:
1、磁力架:建议使用DynaMagTM-2(货号: 12321D)。
2、DNA纯化回收试剂盒:建议使用百奥莱博磁珠法DNA纯化回收试剂盒(货号: WE0205)。
3、样本接头引物试剂盒:建议使用百奥莱博二代测序多样本接头引物试剂盒 I/II(货号:WE0241/WE0240)。
4、无水乙醇,EB(10 mM Tris-HCl, pH 8.0),去离子水(pH 在7.0-8.0之间)。
5、反应管:建议使用低吸附的PCR管与1.5ml离心管;枪头:建议使用高质量过滤枪头防止试剂盒、文库样本污染
实验前准备及重要注意事项:
1、避免试剂的反复冻融,建议您首次使用试剂盒后将剩余试剂分装保存。
2、PCR产物因操作不当极易产生污染,导致实验结果不准确,建议将PCR反应体系配制区与PCR产物纯化区隔离,并使用专门的移液器,定时对各实验区域进行清洁。
DNA建库流程示意图:
操作步骤:
样本要求: 5ng-1μg打断的双链DNA,溶于EB(10 mM Tris-HCl pH 8.0)或去离子水中。DNA纯度要求:OD260/OD280=1.8~2.0。
DNA末端修复反应:
1、向200μl PCR管中加入以下试剂:
试剂 | 体积 |
10×End Repair Reaction Buffer | 6.5μl |
End Prep Enzyme Mix | 2μl |
fragmented DNA | X(5ng-1μg) |
RNase-free Water | Up to 65μl |
2、用枪头将上述溶液轻轻吹吸混匀,短暂离心,使所有组分收集到管底。
3、将上述PCR管置于PCR仪中,热盖打开, 反应程序如下:
15 min @ 12℃
15 min @ 37℃
20 min @ 72℃
Adaptor 连接:
建议使用百奥莱博adaptor进行连接,也可选择使用NEB、illumina公司的adaptor,具体连接方法可参考各公司的产品使用说明书。以下为使用百奥莱博adaptor进行连接的操作步骤:
1、向上述已完成DNA末端修复的反应液中直接加入以下试剂:
试剂 | 体积 |
T4 DNA ligase buffer for illumina | 14μl |
T4 DNA ligase | 2μl |
Adaptor | 2.5μl |
此时管中溶液总体积为83.5μl。
注意:若起始样本量少于100ng,请将adaptor用去离子水稀释10倍至1.5μM后使用。
2、用枪头将上述试剂吹吸混匀,短暂离心,使溶液收集到管底。
3、20℃温浴15分钟。
注意:若此操作使用pcr仪,请将热盖关闭。
DNA片段的选择性回收:
建议使用百奥莱博磁珠法DNA纯化回收试剂盒(WE0205)进行DNA片段选择性回收。
注意:DNA片段选择性回收是可选步骤,若起始样本量低于50ng,不建议进行DNA片段选择性回收,直接进行DNA片段的纯化。另外构建不同大小的DNA文库时,DNA片段选择性回收的磁珠使用量不同,具体磁珠用量可参照附表1(若使用除百奥莱博以外厂家的磁珠,需自行摸索最佳磁珠用量)。
以下操作步骤中,可选择回收DNA片段长度峰值为320bp(插入片段长度200bp),反应起始体积为100μl。
1、涡旋振荡MCPure20秒,使其彻底混匀为均一溶液。
2、向连接反应液中加入16.5μl去离子水,使adaptor连接反应缓冲液体积至100μl。
注意:若使用NEB adaptor,只需要加入13.5μl去离子水。
3、将上述adaptor反应缓冲液转移至一新的1.5ml离心管中。
4、加入70μl混合均匀的MCPure,涡旋震荡5秒钟后, 室温静置5分钟。
5、短暂离心,将离心管置于磁力架上,使磁珠和上清溶液分离,直至溶液澄清(约需5分钟),小心地将上清溶液转移至新的1.5ml离心管中,并弃去磁珠。
注意:不要弃除上清。
6、向上清中加入25μl混合均匀的MCPure,涡旋震荡5秒钟后室温放置5分钟。
7、短暂离心,将离心管放于磁力架上,使磁珠和上清溶液分离,直至溶液澄清(约需5分钟),小心吸取上清并弃除,期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。
注意:不要弃除磁珠。
8、继续保持离心管固定于磁力架上,向离心管中加入250μl新配置的80%乙醇,室温放置30秒,待悬起的磁珠完全吸附后,小心弃除上清。
9、重复步骤8。
10、保持离心管固定于磁力架上,室温静置10分钟,使磁珠在空气中干燥。
11、将离心管从磁力架上取下,加入28μl 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)或去离子水(自备),涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中,室温静置5分钟。
12、短暂离心,将离心管放于磁力架上直至溶液澄清(约需5分钟),将23μl洗脱液转移至一个新的PCR管中;
注意:一定不要转移磁珠,微量磁珠污染可影响后续PCR反应的正常进行。
另一种方案: DNA片段的纯化:
1、涡旋振荡MCPure20秒,使其彻底混匀为均一溶液。
2、将adaptor连接反应液转移至一新的1.5ml离心管中。
3、加入1倍样品体积的MCPure,涡旋震荡5秒钟后,室温静置5分钟。
4、短暂离心,将离心管放于磁力架上,使磁珠和上清溶液分离,直至溶液澄清(约需5分钟),小心吸取上清并弃除,期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。
注意:不要弃除磁珠。
5、继续保持离心管固定于磁力架上,向离心管中加入250μl新鲜配置的80%乙醇,室温放置30秒,待悬起的磁珠完全吸附后,小心弃除上清。
6、重复步骤5。
7、保持离心管固定于磁力架上,室温静置10分钟,使磁珠在空气中干燥。
8、将离心管从磁力架上取下,加入28μl EB(自备)或去离子水,涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中,室温静置5分钟。
9、短暂离心,将离心管放于磁力架上直至溶液澄清(约需5分钟),将23μl洗脱液转移至一个新的PCR管中。
附表1:不同片段选择回收时磁珠建议用量
DNA文库大小 | 插入片段 | 150bp | 200bp | 250bp | 300-400bp | 400-500bp | 500-700bp |
插入片段+adaptor | 270bp | 320bp | 400bp | 400-500bp | 500-600bp | 600-800bp | |
磁珠用量 | 第一次选择 | 85 | 70 | 55 | 50 | 45 | 35 |
第二次选择 | 25 | 25 | 20 | 20 | 20 | 15 |
PCR扩增:
1.在PCR管中加入以下试剂并混匀。
试剂 | 体积 |
连接adaptor后的DNA片段 | 23μl |
2×HiFid elity PCR Mix | 25μl |
Univesial primer | 1μl |
Index primer | 1μl |
总体积 | 50μl |
2、PCR反应条件:
步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 98℃ | 30 s | |
变性 | 98℃ | 10 s | 6-16个循环 |
退火 | 65℃ | 30 s | |
延伸 | 72℃ | 30 s | |
终延伸 | 72℃ | 5 min |
注意:建议1μg样本起始量时PCR循环数为6个循环,50ng时10个循环,5ng时14-15个循环,PCR循环数也可根据实验需要进行优化。
PCR产物的纯化:
1、涡旋振荡MCPure20秒,使其彻底混匀为均一溶液。
2、将PCR反应液转移至一新的1.5ml离心管中。
3、加入1倍样品体积的MCPure,涡旋震荡5秒钟后室温静置5分钟。
4、短暂离心,将离心管放于磁力架上,使磁珠和上清溶液分离,直至溶液澄清(约需5分钟)。小心吸取上清并弃除,期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。
注意:不要弃除磁珠。
5、继续保持离心管固定于磁力架上,向离心管中加入250μl新鲜配置的80%乙醇,室温放置30秒,待悬起的磁珠完全吸附后,小心弃除上清。
6、重复步骤5。
7、保持离心管固定于磁力架上,室温静置10分钟,使磁珠在空气中干燥。
8、将离心管从磁力架上取下,加入30μl EB(自备)或去离子水,涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中,室温静置5分钟。
9、短暂离心,将离心管放于磁力架上直至溶液澄清(约需5分钟),将洗脱液转移至一个新的PCR管中约25μl,DNA文库在-20℃保存。
文库质量检测
文库浓度:
为了得到高质量的测序结果,需要对DNA文库进行精确定量,首先推荐使用Real-time PCR方法对DNA文库进行绝对定量。此外,还可使用荧光染料法,如Qubit法或荧光染料picogreen法,此处请勿使用基于吸光度测量的定量方法。最终可使用以下近似公式换算DNA文库的摩尔浓度。
文库平均总长度 | 近似转换公式 | 成簇反应DNA文库浓度 |
200 bp | 1ng/μl=7.5 nM | 6-12 pM |
300 bp | 1ng/μl=5.0 nM | 6-12 pM |
400 bp | 1ng/μl=3.8 nM | 6-12 pM |
500 bp | 1ng/μl=3.0 nM | 6-12 pM |
文库长度分布
制备好的DNA文库可用琼脂糖凝胶电泳或Agilent 2100 Bioanalyzer检测DNA文库中的片段长度分布范围。
图1:Agilent 2100 Bioanalyzer文库分析结果
L:DNA Ladder;
S:使用200ng人基因组DNA构建文库,磁珠进行选择回收后结果。
文库结构
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT [Target Sequence] TGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’
NNNNNN:index, 6bases
储存条件:-20℃
北京百奥莱博科技有限公司
实名认证
钻石会员
入驻年限:9年