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文献和实验
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英文名 ：Biotin Labeling Kit-NH2
规格 ：3 samples（50-200 μg）
蛋白质组学的蛋白质标记试剂和试剂盒Biotin Labeling Kit-NH2 生物素标记试剂盒-氨基
货号：LK03
特点：整个标记过程仅需1个小时
整个标记过程在1支过滤管中进行
荧光标记抗体回收率高
适用于50-200 μg的IgG
该试剂盒主要用于制备生物素标记的蛋白质，用于酶免疫分析（EIA）。NH2-reactive biotin是试剂盒的成分之一，它含有琥珀酰亚胺基（NHS），能与蛋白质或者其它分子的氨基反应。该试剂盒中包含了标记所需的全部试剂，标记过程十分简便。只需将NH2-reactive biotin加入到IgG溶液中， 37℃ 培养10分钟即可。每个IgG分子平均能够和5-8个生物素分子结合。过量的生物素分子能够使用过滤管将其除去。
备注：经过同仁化学研究所的长期稳定性考验，代码为LK03的产品在0-5℃未开封的条件下由原来可以保存半年延长至一年。
注意事项：
用该试剂盒标记的蛋白质的分子量要>50,000。
在标记过程中，IgG或者biotin-IgG标记物始终在Filtration tube的滤膜上。
如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits（不包含于本试剂盒中）来纯化。
如果IgG溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。
如果长时间不使用，建议您把试剂盒中的标记试剂NH2-reactive biotin放在-20℃冰箱中保存，不需要充氮气，可以更好地保持标记试剂的活性，但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中，仍请放在0-5℃冰箱中保存。
标记IgG操作步骤
（1）将100 μl WS buffer以及含有100 μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a）
（2）8,000-10,000 g离心10分钟。b）
（3）将10 μl DMSO加入到NH2-reactive biotin中并用移液器吹打使其溶解。c）
（4）将100 μl Reaction buffer以及8 μl NH2-reactive biotin溶液加入到过滤管中，吹打使其混合。d）
（5）将过滤管放入培养箱中，37℃培养10分钟。
（6）将100 μl WS buffer加入到过滤管中，8,000-10,000 g离心10分钟，b）除去滤液。
（7）将200 μl WS buffer加入到过滤管中，8,000-10,000 g离心10分钟，b）重复该步骤一次。
（8）将200 μl WS buffer加入到过滤管中吹打10-15次来回收标记产物。e）将该溶液转移到0.5 ml试管中，在0-5℃下保存。
a）样品溶液的体积不应超过100 μl。如果抗体浓度低于1 mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100 μg。如果聚积过程中滤液的体积超过400 μl，则在进行后续的离心操作前应除去滤液。
b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c）NH2-reactive biotin在管子的底部，向管底加入10 μl DMSO，吹打数次使其溶解。
d）如果IgG的量为200 μg，在步骤4时加入所有的NH2-reactive biotin溶液。
e）并不一定要使用WS buffer来回收标记产物，可以选择任何适合于该实验的缓冲液来替代。
生物素/蛋白质 比率的测定每个IgG平均可以和5-8个生物素结合。如果需要知道精确的结合数的话，可以做一下HABA试验。参照以下HABA试验的操作说明。
用该试剂盒标记的蛋白质的分子量要>50,000。
在标记过程中，IgG或者biotin-IgG标记物始终在Filtration tube的滤膜上。
如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits（不包含于本试剂盒中）来纯化。
如果IgG溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。
如果长时间不使用，建议您把试剂盒中的标记试剂NH2-reactive biotin放在-20℃冰箱中保存，不需要充氮气，可以更好地保持标记试剂的活性，但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中，仍请放在0-5℃冰箱中保存。
标记IgG操作步骤
（1）将100 μl WS buffer以及含有100 μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a）
（2）8,000-10,000 g离心10分钟。b）
（3）将10 μl DMSO加入到NH2-reactive biotin中并用移液器吹打使其溶解。c）
（4）将100 μl Reaction buffer以及8 μl NH2-reactive biotin溶液加入到过滤管中，吹打使其混合。d）
（5）将过滤管放入培养箱中，37℃培养10分钟。
（6）将100 μl WS buffer加入到过滤管中，8,000-10,000 g离心10分钟，b）除去滤液。
（7）将200 μl WS buffer加入到过滤管中，8,000-10,000 g离心10分钟，b）重复该步骤一次。
（8）将200 μl WS buffer加入到过滤管中吹打10-15次来回收标记产物。e）将该溶液转移到0.5 ml试管中，在0-5℃下保存。
a）样品溶液的体积不应超过100 μl。如果抗体浓度低于1 mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100 μg。如果聚积过程中滤液的体积超过400 μl，则在进行后续的离心操作前应除去滤液。
b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。
c）NH2-reactive biotin在管子的底部，向管底加入10 μl DMSO，吹打数次使其溶解。
d）如果IgG的量为200 μg，在步骤4时加入所有的NH2-reactive biotin溶液。
e）并不一定要使用WS buffer来回收标记产物，可以选择任何适合于该实验的缓冲液来替代。
生物素/蛋白质 比率的测定每个IgG平均可以和5-8个生物素结合。如果需要知道精确的结合数的话，可以做一下HABA试验。参照以下HABA试验的操作说明。
用HABA法计算蛋白质的生物素标记率
1. 原理
生物素对蛋白质的标记率采用HABA(4-Hydroxy-azobenzene-2’-carboxylic acid)的方法计算。
HABA和亲和素结合后在500 nm会有吸收。由于生物素-亲和素的亲和性比HABA-亲和素的高，所以在HABA-亲和素溶液中加入生物素标记蛋白，生物素会取代HABA和亲和素结合。因为HABA和亲和素解离会导致在500 nm的吸光度减少，故利用此原理可以计算生物素的标记率。
2. 试剂
• 亲和素 ：10 mg
• HABA ： 14 mg
• DMSO ：500 μl
• PBS buffer(pH 7.4)：20 ml
8.0 g/l NaCl,0.2 g/l KCl,1.15 g/l Na2HPO4,0.2 g/l KH2PO4
3. 测定及计算方法
1) 在2 ml样品管中精确称量14.0 mg HABA后，用移液器加入500 μl DMSO溶解制成HABA溶液。
2) 在20 ml容量瓶中精确称量10.0(±0.1) mg 亲和素后，加入15 ml PBS溶解。然后用移液器加入200 μl上述配制好的HABA溶液后，补充PBS至20 ml，充分混合，制成HABA-亲和素溶液。
3) 用移液器吸取900 μl配制好的HABA-亲和素溶液至微型比色槽（ 容量1 ml，长1 cm）中，测定在500 nm的吸光度，重复测定3次的平均值作为AbsA，这时的AbsA值大约为1.5。
4) 用移液器吸取900 μl配制好的HABA-亲和素溶液至2 ml样品管中，然后加入100 μl纯化的标记蛋白质溶液，旋紧盖子后，用Vortex混匀。
5) 静置5 min（以上），用移液器转移至微型比色槽中，测定在500 nm的吸光度，作为AbsB。如果蛋白质浓度过高，会造成生物素比亲和素多，有时会出现无法计算出和蛋白质结合的准确生物素数量的情况。所以如果AbsB<0.7，建议先适当稀释蛋白质溶液（稀释倍率：Z），然后加入HABA-亲和素溶液，计算出标记率。
6) 按照以下公式计算出样品中的生物素浓度B(mol/l)。
B(mol/l)=Z×[10-2×(0.9×AbsA-AbsB)/34]
7) 也可以计算出1个分子蛋白质上结合的生物素数量。例如按照Ⅳ.用Biotinylation Kit(Sulfo-OSu)中的生物素标记方法，标记X g分子量为MWprotein的蛋白质，纯化后的蛋白质浓度A(mol/l)可以表示如下：
A(mol/l)=(X/MWprotein) ×103
在1个分子蛋白质上结合的生物素数量(mol/mol)=B/A。
蛋白质标记试剂可用于各种与抗原-抗体反应相偶合的各种检定。其中，荧光素、生物素以及酶标记试剂是常用的几种抗体标记试剂。多数蛋白质标记试剂具有相似的反应位点，例如用于氨基的琥珀酰亚胺酯（NHS）以及用于巯基的马来酰亚胺或溴乙酰胺。Dojindo提供以下用于蛋白质研究及蛋白质组学的蛋白质标记试剂和试剂盒。
1. 原理
生物素对蛋白质的标记率采用HABA(4-Hydroxy-azobenzene-2’-carboxylic acid)的方法计算。
HABA和亲和素结合后在500 nm会有吸收。由于生物素-亲和素的亲和性比HABA-亲和素的高，所以在HABA-亲和素溶液中加入生物素标记蛋白，生物素会取代HABA和亲和素结合。因为HABA和亲和素解离会导致在500 nm的吸光度减少，故利用此原理可以计算生物素的标记率。
2. 试剂
• 亲和素 ：10 mg
• HABA ： 14 mg
• DMSO ：500 μl
• PBS buffer(pH 7.4)：20 ml
8.0 g/l NaCl,0.2 g/l KCl,1.15 g/l Na2HPO4,0.2 g/l KH2PO4
3. 测定及计算方法
1) 在2 ml样品管中精确称量14.0 mg HABA后，用移液器加入500 μl DMSO溶解制成HABA溶液。
2) 在20 ml容量瓶中精确称量10.0(±0.1) mg 亲和素后，加入15 ml PBS溶解。然后用移液器加入200 μl上述配制好的HABA溶液后，补充PBS至20 ml，充分混合，制成HABA-亲和素溶液。
3) 用移液器吸取900 μl配制好的HABA-亲和素溶液至微型比色槽（ 容量1 ml，长1 cm）中，测定在500 nm的吸光度，重复测定3次的平均值作为AbsA，这时的AbsA值大约为1.5。
4) 用移液器吸取900 μl配制好的HABA-亲和素溶液至2 ml样品管中，然后加入100 μl纯化的标记蛋白质溶液，旋紧盖子后，用Vortex混匀。
5) 静置5 min（以上），用移液器转移至微型比色槽中，测定在500 nm的吸光度，作为AbsB。如果蛋白质浓度过高，会造成生物素比亲和素多，有时会出现无法计算出和蛋白质结合的准确生物素数量的情况。所以如果AbsB<0.7，建议先适当稀释蛋白质溶液（稀释倍率：Z），然后加入HABA-亲和素溶液，计算出标记率。
6) 按照以下公式计算出样品中的生物素浓度B(mol/l)。
B(mol/l)=Z×[10-2×(0.9×AbsA-AbsB)/34]
7) 也可以计算出1个分子蛋白质上结合的生物素数量。例如按照Ⅳ.用Biotinylation Kit(Sulfo-OSu)中的生物素标记方法，标记X g分子量为MWprotein的蛋白质，纯化后的蛋白质浓度A(mol/l)可以表示如下：
A(mol/l)=(X/MWprotein) ×103
在1个分子蛋白质上结合的生物素数量(mol/mol)=B/A。
1.能够用这个试剂盒标记其他蛋白质吗？
可以。只要标记分子的分子量>50,000。
2.标记蛋白之前是否必须使用过滤管？
如果蛋白溶液中不含有带有氨基的小分子且蛋白浓度在10 mg/ml或者70 μM左右时，可以不使用过滤管来过滤，只需要将10 μl 样品溶液和90 μl Reaction Buffer混合，将混合液加入到NH2-reactive biotin管中。反应后，将反应液移入过滤管中，并从步骤6开始按照操作说明上的方法做后续试验。
3.是否必须要用WS buffer来储存标记产物？
不一定要使用WS buffer，可以使用任何适合该实验的缓冲液。
4.我的样品溶液中含有小的不溶物，应该怎么办？
低速离心后取上清液进行标记。
5.标记产物能保存多久？
在0-5℃下能够保存2个月。如果需要保存更久，可以添加等量的丙三醇，并在-20℃下（只要该蛋白可以冷冻）存放。但是，还要注意样品自身是否稳定。
6.用该试剂盒所能标记的IgG的最小量是多少？
IgG的最小量为10 μg。10 μg-100 μg的IgG的标记比率是一样的。
蛋白质标记试剂可用于各种与抗原-抗体反应相偶合的各种检定。其中，荧光素、生物素以及酶标记试剂是常用的几种抗体标记试剂。多数蛋白质标记试剂具有相似的反应位点，例如用于氨基的琥珀酰亚胺酯（NHS）以及用于巯基的马来酰亚胺或溴乙酰胺。Dojindo提供以下用于蛋白质研究及蛋白质组学的蛋白质标记试剂和试剂盒。
| 官能基 | 品名 | 检出 | λex | λem | |
| 蛋白质抗体标记试剂盒 | 氨基or巯基 | Alkaline Phosphatase Labeling Kit-NH2，-SH | 基质 | - | - |
| Peroxidase Labeling Kit-NH2，-SH | 基质 | - | - | ||
| Biotin Labeling Kit- NH2，-SH | 基质 | - | - | ||
| Fluorescein Labeling Kit-NH2 | 荧光 | 500 | 525 | ||
| HiLyte FluorTM555 Labeling Kit-NH2 | 荧光 | 555 | 570 | ||
| HiLyte FluorTM647 Labeling Kit-NH2 | 荧光 | 655 | 670 | ||
| HiLyte FluorTM750 Labeling Kit-NH2 | 荧光 | 760 | 780 | ||
| Allophycocyanin Labeling Kit-NH2，-SH | 荧光 | 650 | 660 | ||
| R- Phycoerythrin Labeling Kit-NH2，-SH | 荧光 | 564 | 575 |
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