环腺苷酸（cAMP）ELISA检测试剂盒

背景介绍：
cAMP和cGMP都是小分子的环状核苷酸，以微量存在于动植物细胞和微生物中，被称其为细胞内的第二信使（激素为第一信使）。
cAMP（或cGMP）由腺苷酸（或鸟苷酸）环化酶产生，被磷酸二酯酶降解，因此激活腺苷酸（或鸟苷酸）环化酶或者抑制磷酸二酯酶，可以提高细胞内cAMP（或cGMP）的含量。研究发现，cAMP（或cGMP）特异性磷酸二酯酶的抑制剂可用于人类疾病的治疗。如：增强β肾上腺素能受体（cAMP的封闭剂）已被用于心率失调、高血压、心肌梗死等心脏疾病；cAMP特异性磷酸二酯酶2/4的抑制剂正在进行认知增强方面的临床测试；而cGMP特异性磷酸二酯酶类型5可用于治疗ED等疾病。
在五十年的研究历程中，从开始研究cAMP，cGMP在各种生理过程中的调节作用，到近几年与之相关的药物研发，药物筛选领域，人们一直在努力寻找一种快速、灵敏、特异性和可重复地定量检测cAMP和cGMP含量的方法。
cAMP，cGMP分子量分别只有329.21和345.21，在机体内的含量极低，为pmol/L级别，用一般的分析方法无法测定。70年代一系列测定cAMP和cGMP的方法被发明出来，最基本的原理有三种：分别是竞争性蛋白质结合分析法、放射性免疫分析法和薄层色谱法。
本试剂盒利用竞争酶联免疫分析方法来测定细胞提取物或体外腺苷酸环化酶实验中的cAMP的水平。包被羊抗鼠多克隆抗体在酶标板上，细胞提取物或体外腺苷酸环化酶实验中的cAMP与固定数量的标记辣根过氧化物酶的cAMP竞争性的结合抗cAMP单克隆抗体，采用已知浓度的cAMP标准品来做标准曲线。检测450nm波长下的OD值，吸光度OD值与样品中cAMP的浓度呈反比关系。基于cAMP标准品所得曲线，通过测得的OD值可以计算出样品中cAMP的浓度，本试剂盒IC50（50% B/B0）约12pmol/mL，检测限约0.15 pmol/mL。

试剂盒组成:
 

试剂盒	产品编号	保存温度
cAMP standard(10000 pmol/mL cAMP, 1x0.1mL)	Cat.No:EKT0001-1	-80°C
cAMP-HRP Conjugate（1000x stock of HRP conjugated with cAMP, 1x0.02mL）	Cat.No: EKT0001-2	-80°C
cAMP Antibody （Anti-cAMP monoclonal antibody (1000X stock), 1x0.02mL）	Cat.No: EKT0001-3	-80°C
Assay Buffer(10x) （phosphate buffer with preservative, 1x30mL）	Cat.No: EKT0001-4	2-8℃
Neutralizing Reagent（Tris buffered saline with preservative, 1x8mL）	Cat.No: EKT0001-5	2-8℃
Sample Diluent（0.1M HCl, only required for extraction of samples and diluting standard, 1x30mL）	Cat.No: EKT0001-6	2-8℃
TMB Substrate （3,3’,5,5’Tetramethylbenzidine, 1x18mL）	Cat.No: EKT0001-7	2-8℃
Stop Solution（2M sulphuric acid, 1x8mL）	Cat.No: EKT0001-8	2-8℃
Goat anti-Mouse IgG Coated microtiter plate （12x8 well strips in a bag with desiccant）	Cat.No: EKT0001-9	2-8℃

所需材料：
酶标仪（检测波长450 nm，参比波长630nm）
加样枪
EP管
孔板振荡器
吸水纸
去离子水

样本处理：
注意事项：
试剂准备：
cAMP标准品溶液

1. 取8个新EP管，分别标记1-8#。在1#管中加入980 μl 0.1M HCl，2-8#管中分别加500 μl 0.1M HCl。加入20μl 标准品（10000 pmol/mL）到1#管中，剧烈振荡。从1#管中取去500μl加入2#管，剧烈振荡。同样方法完成3-8#管的稀释（1-8#管cAMP浓度分别是200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56pmol/ml）。稀释好的标准品建议在15min内使用。另外，标记一个新EP管为B0（maximum binding，0pmol/ml），加入500μl 0.1M HCl。

“Assay Buffer工作液”的准备

1. 将本试剂盒的Assay Buffer（10×）（30 ml） 加入270 ml去离子水中。
   注：配好的Assay Buffer工作液可室温保存3个月（但不能超出试剂盒的保质期）
2. “cAMP-HRP Conjugate工作液”的准备
   用配好的Assay Buffer按1:1000 将cAMP-HRP Conjugate（1000×）稀释至工作液。.

实验步骤：
注：所有标准品管包括B0管以及样品管均要加入相同体积的Neutralizing Buffer，并立即振荡2sec.

1. 每个孔中加入50 µl Neutralizing Buffer。TA （Total Activity）和空白孔除外。
2. 加50 µl 0.1M HCl至NSB孔（Non-Specific Binding）和B0孔。
3. 分别取50 µl各浓度标准品溶液至相应孔中。.
4. 取50 µl样品溶液至相应孔中。
5. 各取50 µl Assay Buffer工作液至NSB孔中。
6. 取50 µl cAMP-HRP Conjugate工作液至各孔中（TA和空白孔不加）。
7. 取50 µl Anti-cAMP monoclonal antibody至各孔中（TA、空白和NSB孔不加）。
8. 室温孵育2 hrs。
9. 倒空，用Assay Buffer工作液洗4遍，每次倒干净残余液体。
10. 加入5 µl cAMP-HRP Conjugate工作液至TA孔中。
11. 取150 µl TMB Substrate至各孔中，室温静置10min左右。 
12. 加50 µl Stop Solution至各孔中，并立即上酶标仪读数（检测波长为450nm，参比波长为630nm）。扣除每个读数的Blank（空白）孔光密度值。

Well	Neutralizing Buffer	0.1M HCl	Standard/Sample	HRP-cAMP Conjugate	cAMP mAb	Assay Buffer
Blank	-	-	-	-	-	-
TA	-	-	-	5μl	-	-
NSB	50μl	50μl	-	50μl	-	50μl
B0	50μl	50μl	-	50μl	50μl	-
Standard /Sample	50μl	-	50μl	50μl	50μl	-

 

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

Blank

S1

S1

SP1

SP16

SP17

SP32

SP33

SP48

SP49

SP64

SP65

B

Blank

S2

S2

SP2

SP15

SP18

SP31

SP34

SP47

SP50

SP63

SP66

C

NSB

S3

S3

SP3

SP14

SP19

SP30

SP35

SP46

SP51

SP62

SP67

D

NSB

S4

S4

SP4

SP13

SP20

SP29

SP36

SP45

SP52

SP61

SP68

E

B0

S5

S5

SP5

SP12

SP21

SP28

SP37

SP44

SP53

SP60

SP69

F

B0

S6

S6

SP6

SP11

SP22

SP27

SP38

SP43

SP54

SP59

SP70

G

B0

S7

S7

SP7

SP10

SP23

SP26

SP39

SP42

SP55

SP58

SP71

H

TA

S8

S8

SP8

SP9

SP24

SP25

SP40

SP41

SP56

SP57

SP72

Blank: only contains substrate.
TA: Total activity, contains cAMP-HRP conjugate (5µl) and substrate.
NSB: Non-specific binding, contains neutralizing buffer, cAMP-HRP conjugate and substrate.
B0: 0 pg/mL standard, contains neutralizing buffer, cAMP-HRP conjugate, Anti-cAMP monoclonal antibody and substrate. 
S1-S8: Standards 1-8       
SP1-SP72: samples

结果计算：
 

1. 样品和标准品的净OD平均值的计算： 净OD平均值=OD平均值-NSB孔OD平均值
2. 结合率（各浓度标准品的结合率占最大结合率（B0孔）的百分比）计算： 结合率（B/B0）=（净OD平均值/B0孔OD平均值）×100
3. 用软件（如Curve Expert或ELISA Calc）进行结合率（或净OD平均值）对Log（cGMP标准品浓度）的三次多项式回归曲线拟合（three order polynomial linear regression curve）或指数Logistic曲线拟合。
4. 通过样品的结合率即可计算出样品中cAMP浓度。

典型标准曲线：  


注：每次实验需重新制作标准曲线

注：通常相关系数R值大于0.99

交叉反应
 

Compound	Cross Reactivity
cAMP	100%
GMP	<0.0001%
GTP	<0.0001%
cAMP	<0.0001%
AMP	<0.0001%
ATP	<0.0001%
cUMP	<0.0001%
CTP	<0.0001%