甲基化分析

提供商 ：博仕生物医学服务中心

服务名称 ：甲基化分析

DNA甲基化分析：
DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。
原理：DNA的甲基化是在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶转变为5'甲基胞嘧啶。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但是它调控了基因的表达，DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。

关键词一CpG岛：
哺乳动物中，CpG序列在基因组中出现的频率仅有1%，远低于基因组中的其它双核苷酸序列。但在基因组的某些区域中，CpG序列密度很高，可以达均值的5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，形成所谓的CpG岛，CpG岛主要位于基因的启动子（promotor）和第一外显子区域，约有60%以上基因的启动子含有CpG岛，其GC含量大于50%,长度超过200bp，在300-3000个碱基不等。
在哺乳动物基因组中约有4万个CpG岛，甲基化一般发生在CpG岛的胞嘧啶处。正常细胞的CpG岛由于被保护而处于非甲基化状态。以往的研究证明启动子区的高甲基化导致抑癌基因失活是人类肿瘤所具有的共同特征之一，而且这种高甲基化是导致抑癌基因失活的又一个机制。

研究方法：
随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。这些方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。针对这三类方法，我们各选出一种常用的方法来介绍，并提供相应的服务。

方法一
基因组整体水平的甲基化检测
甲基化芯片分析：
针对所有的CpG岛设计探针序列制作成芯片，如Agilent、Roche（NimbleGen）的甲基化芯片，设计CpG岛4万多个，覆盖人类全基因组所有的CpG岛及把有可能做为调控元件的富含CG位点的片 段都包含进来，并通过甲基化片段特异性结合蛋白或抗体，将甲基化位点片段富集起来，并通过芯片杂交获知全面的甲基化信息，见下图：


应用：
 全基因组范围内检测甲基化位点。
 研究启动子甲基化对基因的调控
 比较不同细胞、组织、肿瘤的甲基化图谱

服务内容描述；通过对照样品和目标样品的对照杂交分析获得基因组水平的DNA甲基化的表观遗传数据。可选用的芯片有Agilent和Roche的Nimblegen甲基化芯片，并提供后期的单个基因的验证实验。
客户方提供：组织细胞样品或抽提好的基因组DNA，保证样品质量。
样品要求：
细胞：≥10的6次方 组织≥100mg
全血：≥1.0ml 基因组DNA≥10ug
服务流程：
a．样品基因组DNA抽提，质检。
b．DNA超声粉碎,甲基化片段富集，荧光标记。
d．芯片杂交
e．数据分析
服务周期：
1个月左右。
服务方提供：样品质控数据，芯片杂交数据库附光盘。
质控验收标准：样品质控数据、芯片内部质控数据。

方法二
甲基化特异性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的
胞嘧啶不变；设计两对引物分别只能与重亚硫酸盐处理后的序列互补配对，即一对结合处理
后的甲基化DNA链，另一对结合处理后的非甲基化DNA链。电泳检测MSP扩增产物，如
果用针对处理后甲基化DNA链的引物能扩增出片段，则说明该被检测的位点存在甲基化；
若用针对处理后的非甲基化DNA链的引物扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化。
见下图

方法评价：
1. 优点：
a敏感性高，可用于石蜡包埋样本等微量样品的检测；
b操作简单，不需要测序；
2. 缺点是：.
a要预先知道待测片段DNA的序列；只能调查引物覆盖位点的甲基化状况
b.引物设计至关重要；
c.若待测DNA中5-甲基胞嘧啶分布极不均衡，则检测时较为复杂；
d.这种方法只能作定性研究，即只能明确是否存在甲基化，不能准确的定量；
e.存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性。

服务内容描述；针对要调查的甲基化位点，分别设计甲基化和非甲基化扩增引物，调试并优化反应条件，通过对亚硫氢酸盐处理前和处理后的样品的PCR扩增电泳分析获得DNA甲基化的位点信息。
客户方提供：组织细胞样品或抽提好的基因组DNA，保证样品质量。
样品要求：
细胞：≥10的5次方 组织≥黄豆大小即可
全血：≥0.5ml 基因组DNA≥5ug
同时提供要检测的基因名称、种属（附genebank号）和要调查的序列和甲基化位点。
和
服务流程：
a甲基化扩增引物设计合成调试
b样品基因组DNA抽提
c亚硫酸氢盐处理
d扩增、电泳分析
服务周期：
单个基因，1－2周，多样品多基因，根据具体情况而定。
服务方提供：PCR电泳图谱等原始数据。
质控验收标准：电泳图谱。

方法三
亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）：
重亚硫酸氢盐处理并测序是Frommer等提出的研究DNA甲基化方法。过程是：重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变（见下图），PCR扩增所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，最后,对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较,判断CpG位点是否发生甲基化。此方法是一种可靠性及精确度很高的方法，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但PCR产物直接测序的成功率低，一般克隆测序的成功率会大大提高，但相应成本也增加。

示意图：DNA经重亚硫酸氢盐处理后，甲基化的胞嘧啶不变，未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，尿嘧啶经过PCR扩增，转变为胸腺嘧啶T。
方法评价：
优点：能系统的了解所调查序列的甲基化状况；获得序列的金标准信息。
缺点是：PCR产物直接测序成功率低，而克隆测序会提高成本。

服务内容描述；提供对目标基因调控位点的亚硫酸氢盐处理/PCR扩增克隆测序分析，获知调查序列内CpG的甲基化位点信息。
客户方提供：组织细胞样品或抽提好的基因组DNA，保证样品质量。
样品要求：
细胞：≥10的5次方 组织≥黄豆大小即可
全血：≥0.5ml 基因组DNA≥5ug
同时提供要检测的基因名称、种属（附genebank号）和要调查的序列。
服务流程：
a甲基化扩增引物设计合成调试
b样品基因组DNA抽提
c亚硫酸氢盐处理
d扩增、克隆、测序
服务周期：
单基因，2周左右，多样品多基因，根据具体情况而定。
服务方提供：PCR电泳图谱、测序原始数据等。
质控验收标准：测序数据、电泳图谱等。

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