NovoNGS DNA Library FlashPrep Kit for Illumina

规格 ：96

产品概述：
NovoNGS DNA Library FlashPrep Kit for Illumina是针对Illumina高通量测序平台开发的专用试剂盒，可将DNA制备成Illumina高通量测序平台专用的测序文库。该试剂盒采用新型的体外转座技术，只需5分钟即可一步实现DNA的片段化与接头连接，实验操作快速简单，无需经过传统文库制备时的片段化、末端修复、接头连接等繁琐步骤。本试剂盒适用于50ng起始DNA量的基因组文库制备。

特点：
快速、简单、DNA用量少。

质量控制：
试剂盒中提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证文库质量的稳定性和重复性。

适用范围：
适用于将DNA制备成Illumina高通量测序平台专用文库。

产品组成：

Component	A包装(24 rxns)	B包装（96rxns)
NovoTn5 Mix	72μl	288μl
5×Reaction Buffer	160μl	640μl
5×Stop Buffer	200μl	800μl
2×Amplify Mix	600μl	2400μl

保存条件：
除5×Stop Buffer室温保存，其余组分-20℃保存。

建库原理及流程：
转座酶与两种等摩尔量的接头Adapter1及Adapter2混合形成转座复合体。在55℃条件下孵育5min,转座复合体便能一步实现基因组DNA的片段化与加接头两个过程。纯化后的片段化产物经N5xx/N7xx引物（NovoNGS Index Kit for Illumina，提供8种N5引物及12种N7引物的选择，目录号：N237）扩增后，再经过磁珠分选，便可得到测序文库。建库原理及流程示意图如下：
文库结构：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-Index2(i5)-TCGTCGGCAGCGTCAGAT
GTGTATAAGAGACAG-xxxxxxxxx-CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC-Index1(i7)-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’

文库结构：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-Index2(i5)-TCGTCGGCAGCGTCAGAT
GTGTATAAGAGACAG-xxxxxxxxx-CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC-Index1(i7)-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’

Adapter1和Adapter2：转座复合物中包被的两种接头，分别带有N5/N7引物识别序列及转座酶识别序列，文库打断的同时会添加到DNA片段两端
i5和i7：分别代表Index2(i5)和Index1(i7)，均为8 bp
N5和N7：分别携带Index2(i5)和Index1(i7)的引物
-xxxxxxxxx-: 插入序列
操作流程：
适用于将DNA制备成Illumina高通量测序平台专用文库。

1. 实验耗材准备

新鲜配制的80%乙醇、灭菌超纯水、低吸附EP管和PCR管、磁力架、PCR仪、磁珠。

1. 起始DNA的准备与要求

纯化过的DNA溶于灭菌纯水或10mMTris-HCl (pH8.0)，吸光度260/280在1.8~2.0之间。因为转座体用量与DNA起始量密切相关，所以准确测定DNA浓度是实验成功的关键。推荐使用Qubit或荧光染料PicoGreen进行浓度测定，请勿使用以吸光度为基础的任何测定方法。

1. 实验流程：

Step1：DNA片段化

1. 于室温融解5×Reaction buffer，上下颠倒混匀后备用；从4℃取出磁珠，室温静置30min备用。

 

1. 在灭菌PCR管中依次添加各反应组分：

5×Reaction buffer	4μl
DNA	50ng
NovoTn5 Mix	3μl
ddH2O	To  20μl

使用移液器轻轻吹打20次，充分混匀。十分重要！
 

1. 将样品置于PCR仪中，反应程序设置如下：

105℃	热盖
55℃	5min
10℃	10min

 

1. 从PCR仪中取出样品，加入5μl Stop Buffer, 移液器轻柔吹打混匀后再次放回PCR仪，55℃孵育5min后取出。

 

1. 片段化产物纯化

1. 涡旋振荡磁珠，使其充分混匀后，吸取25μl磁珠加入25μl片段化后的产物中，用移液器轻轻吹打10次，充分混匀，室温孵育5 min。
2. 若管壁上有液体，将反应管短暂离心后置于磁力架，使磁珠与液体完全分离，约5 min，小心移除上清。
3. 向反应管中加入200μl新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec后，用枪头小心移除上清，此过程保持PCR管始终置于磁力架中。
4. 重复步骤（3）一次。
5. 保持PCR管置于磁力架上，打开管盖，室温空气干燥5 min左右，切记不可干燥过度。
6. 从磁力架上取下PCR管，加入22μl无菌超纯水洗脱，移液器轻轻吹打混匀，后室温孵育3min；
7. 若管壁有液体，将反应管短暂离心后置于磁力架，室温静置约2 min，使磁珠与液体完全分离，吸取20μl上清至新的PCR管中。

 
Step2：PCR扩增

1. 将灭菌PCR管置于冰浴中配置50μl反应体系

依次添加各反应组分：

2×Amplify Mix	25μl
Step1产物	20μl
N5xx	2.5μl
N7xx	2.5μl

 

1. 移液器轻轻吹打，充分混匀。
2. PCR扩增程序如下：
3. 72℃^*         3min
   98℃       30sec
   98℃       15sec
   60℃       30sec         5-7cycles
   72℃       90sec
   72℃       5min
   10℃       Hold
    
   72℃^*孵育3min为链置换反应，此步骤不可省略。
   PCR循环数多则文库产量高，但对应Duplication会增多，请根据测序需要进行选择。不同循环数对应的文库产出请参照附表一。
   Step3：扩增产物长度分选
   如对文库长度分布无特殊要求，可直接使用1.0×磁珠纯化文库扩增产物，不需进行片段分选。本步骤采用磁珠两步分选法对扩增产物进行长度分，请优选Novoprotein DNA Screen Beads (货号：N240)，如使用其他品牌磁珠，使用方法请以该品牌说明书推荐的体系为准。

   文库平均总长度	~350bp	~450bp	~550bp	~680bp
   文库平均插入长度	~220 bp	~320 bp	~420 bp	~550bp
   第一轮磁珠用量V1	0.7×	0.6×	0.55×	0.45×
   第二轮磁珠用量V2	0.2×	0.15×	0.15×	0.15×

    
   举例：“0.7×”代表磁珠与PCR产物的体积比，若PCR产物体积为50μl，则第一轮磁珠用量0.7×50μl =35μl，第二轮磁珠用量为：0.2×50μl=10μl。
   注意：由于PCR过程中水分蒸发导致PCR产物体积小于50μl，请务必用ddH₂O补齐至50μl，否则会导致分选长度和预期不一致。
   片段筛选：
4. 涡旋振荡混匀磁珠后，吸取V1体积磁珠加入50μl PCR产物中，使用移液枪轻轻吹打充分混匀，室温孵育5 min；
5. 将反应管短暂离心后置于磁力架，使磁珠与液体分离（约5 min，溶液澄清后），
6. 小心转移上清至干净的EP管中，丢弃磁珠；
7. 涡旋振荡混匀磁珠后，吸取V2体积磁珠至上清中，使用移液枪轻轻吹打充分混匀，室温孵育5 min；
8. 将反应管短暂离心后置于磁力架，使磁珠与液体分离（约5 min，溶液澄清后），小心移除上清；
9. 加入200μl新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec后，小心移除上清，此过程仍保持反应管置于磁力架中；
10. 重复步骤（5）一次；
11. 保持反应管置于磁力架中，打开管盖，室温晾干约5min，切记磁珠不要干燥过度；
12. 将反应管从磁力架上取下，加入22μl无菌超纯水洗脱，吹打混匀或涡旋混匀后室温孵育3min；
13. 将反应管短暂离心后置于磁力架，使磁珠与液体完全分离（约2 min，溶液澄清后），小心吸取20μl上清至新的无菌PCR管内中，-20℃保存。
14. 附表一：

    PCR扩增循环次数	4	5	6	7
    文库产出总量（ng）	250	420	800	1300

    注：此处文库产出总量为未进行长度筛选时的结果。