表达载体构建

实验原理

miRNA是在真核生物中发现的具有调控功能的内源性非编码RNA，大小约20~25个核苷酸。我们根据成熟miRNA序列信息，合成含有茎环结构的前体miRNA连接至含侧翼序列的表达载体中(见图6.1），将其转染/病毒包装感染进入细胞后，由II型启动子（CMV）启动表达，经核酸酶的剪切加工，组装RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。

图6.1miRNA表达载体示意图

 

技术应用

通过过表达miRNA研究其功能并进行靶点筛选的后期研究工作

 

实验流程

 

 

	实物	数据信息	实验周期
客户提供	无	miRNA序列信息	10周
我们提供	miRNA表达质粒/菌株、病毒液	基本实验步骤、测序报告

实验结果展示

图1 miRNA 慢病毒包装实验结果 
A：miRNA 慢病毒表达载体测序结果；B：miRNA 慢病毒感染 293 细胞照片。

 

TROUBLESHOOTING

实验问题	原因	推荐解决方法
miRNA过表达质粒构建过 程中未能筛选到阳性克隆？	试剂问题	注意OIigo片段的纯化级别、退火buffer、连接酶体系、感受态细胞的效率等。
miRNA过表达质粒测序 失败？	发夹结构影响测序	更换技术能力更好的测序公司。
miRNA过表达质粒对细胞 转染效率低？	转染条件不佳	采用适合该细胞的转染试剂，优化转染条件。
	细胞本身难转染	采用病毒介导miRNA的过表达。

常见问题FAQ

Q ：为什么选择贵公司进行miRNA的表达载体构建工作？
A ：我们提供miRNA表达载体构建，可以在每一步操作为您把关：Oligo片段经PAGE纯化，质量优良，保证无碱基突变的情况；在载体构建以及测序验证过程中操作经验丰富，可以快速为您构建好所需的miRNA表达载体。
 

Q ：什么是miRNA mimics, miRNA inhibitor?其应用有哪些？
A ：miRNA mimics:运用化学合成的方法，模拟生物体内源的miRNA，特异性增强内源型miRNA的功能。
miRNA inhibitor：化学修饰的专门针对细胞中特异的靶miRNA的抑制剂，可特异高效的抑制生物体内源性miRNA的活性。
以上化学合成片段获取方便快捷，短时间内可以转染细胞，增加或抑制miRNA的活性，检测miRNA所调节的基因表达和对信号通路的影响，对阐明miRNA在诸如细胞发育、增值、分化和凋亡中的机理有重要意义。

 

Q ：miRNA表达载体相对化学合成的miRNA mimics的优势有哪些？
A ：miRNA表达载体相对化学合成miRNA可以进行质粒扩增、抽提，转染细胞或包装慢病毒感染细胞后，表达时长高于miRNA mimics，并且后续可以进行稳转株的构建工作；另外miRNA表达载体含GFP荧光标记，表达荧光更加稳定，方便进行转染或感染后的示踪。

 

参考文献

1. Ambros V.MicroR NAs: Tiny R egulators with Great Potential. Cell 2001;107(7):823-826.

2. Ambros V.The functions of animal micro R NAs.Nature 2004;431(7006):350-355.

3. Bartel DP.MicroR NAs:genomics,biogenesis, mechanism, and function.Cell 2004;116(2):281-297.