EB病毒核酸检测试剂盒PCR荧光探针法

库存 ：100

英文名 ：epstein-barr virus,EBv

保质期 ：有效期6 个月

供应商 ：上海彩佑

保存条件 ：-20±5℃避光保存

规格 ：24T/48T

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【产品名称】
通用名称：EB病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）
【包装规格】
24 人份/盒
【预期用途】本产品用于人体血清或血浆样本中EB病毒核酸的定量检测。
EB 病 毒（ epstein-barr virus,EBv ）， 又名 人疱 疹病 毒 4 型 。 EB 病 毒的感 染非常普 遍，主要通 过唾液感 染，我国 95%以上人 群在 3~5 岁 就已感 染了 EB 病毒 。在 一般 情况下 ，EB 病毒引 起的感染 是无症状的， 尤其 是儿 童时期 。 急 性的 EB 病毒 感染 ， 会引 起传 染性单 核细胞 增多 症， 伴有 急性呼吸道感 染、 发热、 淋 巴结肿大、 肝 、 脾肿大等病 症， 在儿童中 高发。当机体免 疫缺陷或免疫 系统处于抑制 状态时，极易受
EB 病 毒 感染 ， 如 免疫 缺 陷 患 者、 T 细 胞 缺陷 患 者 、 器官移植后接受免 疫抑制治疗常致严重的淋 巴 组 织 增生 性 疾 病 。 此 外 ， EB 病 毒 与 越 来越 多的人 类恶性肿瘤 有关，例如鼻 咽癌、霍奇金 淋巴瘤、非霍奇 金淋巴 瘤等。
实验操作人员应接受过基因扩增或分子生物学方法检测的专业培训，具 备相关的实验操作资格，实验室应具备合理的生物安全防备设施及防护程序。
EB病毒核酸检测试剂盒PCR荧光探针法【检验原理】
本产品选取 EB 病毒基因组 BamH1W 基因设计特异性引物和探针，在 样本 DNA 核酸纯化之后采用荧光 PCR 对病毒 DNA 进行检测。
本产品采用煮沸裂解法提取病毒 DNA 模板，然后在 Taq 酶的作用下对
靶区域进行扩增，同时利用 Taqman 荧光探针技术实时监测扩增产物的累积。 Taqman       探针带有一个荧光发光基团和一个荧光淬灭基团，完整的探针在特定 光源激发下，发光基团所产生的荧光被淬灭基团全部吸收，样品无荧光。PCR 过程中，Taq 酶在延伸 DNA 链的同时，可通过自身的 5’→3’核酸外切酶活性 降解与模板结合的特异性荧光探针，使荧光报告基团与淬灭基团分离，分离 后的荧光报告基团在特定光源激发下产生荧光。通过监测整个 PCR 过程荧光 信号的变化，对未知模板进行定性分析。
同时本产品采用内标质控体系，用于监测反应体系可能存在的抑制因 素。内标模板与靶基因无同源性，内标探针选择的是与靶基因探针没有冲突 的另一检测通道。注：1）不同批号试剂盒中各组分不可以互换。
2）试剂盒以 外必需的设备 及材料： 试剂盒以外必需的设备及材料： 荧光定量 PCR 仪、旋涡混合器、生物安全柜、迷你离心机、干式恒 温仪或 水 浴 锅、 移液器及 无 菌吸 头、离心机及 无 菌离 心 管、PCR 反应管、无粉乳胶手套。
EB病毒核酸检测试剂盒PCR荧光探针法储存条件及有效期】
-20±5℃避光保存，有效期 6 个月。
开封后冻融不超过三次，稳定保存不超过 2 个月。采用冰壶或干冰密封或 泡沫箱加冰密封运输，运输箱规格为 465×305×370cm，内置 7 个冰袋（750g）
+9kg 干冰。
生产日期及失效日期见标签。
【适用仪器】
适用于 ABI 7500、Stratagene Mx3000P 荧光定量 PCR 仪。
【样本要求】
1. 适用样本类型：血清或血浆
2. 样本采集:
2.1 血清 用无菌注射器在受检者手臂弯曲处或手背处抽取静脉血 2ml，待 样本自行析出血清后直接室温 1600rpm 离心 5 分钟分离出血清后转移至 1.5ml 灭菌离心管中备用。
2.2 血浆 用无菌注射器在受检者手臂弯曲处或手背处抽取静脉血 2ml，注 入含有 EDTA 的无菌收集管中，立即轻轻颠倒混匀，待样本自行析出血浆后， 室温 1600rpm 离心 5 分钟分离出血浆后转移至 1.5ml 灭菌离心管中备用。 3.样本保存：
样本收集后立即用冰块保存或置于 4℃。样本在 4℃保存不超过 72 小时，
-20℃条件下可以保存数月，长期保存请将样本置于-70℃。 4 运输：
运 输 过 程 中 应 采 用 不 易 碎 的 容 器 装 载 样 本 ， 并 且 视 作 潜 在 的 传 染 源，避免外 漏。采用冰 壶或干冰密封 或泡沫箱加 冰密封运输 ，避免样 本运输途 中解冻， 影响 检测结果。
【检验方法】
1.样本处理
1.1 样本处理：
1）取 100µl 待检样本，加入 50µl 浓缩液，用漩涡振荡器振荡 15 秒混匀；
2）13,000rpm 离心 10 分钟，小心吸出 150µl 上清液（尽量吸干上清液，但 不要触及沉淀）并弃去，保存沉淀；
3）向离心管中加入 50µl 裂解液，然后用枪头对准沉淀所在位置，将其挑离 管底，并反复吹打，用漩涡振荡器振荡将沉淀充分打散；
4）100℃温浴 10 分钟，13,000rpm 离心 10 分钟后静置待用。
1.2      定量标准品（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）、阴性质控品和内标模板无需抽提，使用 前室温融化混匀。
2.试剂配制
2.1 检测反应设置阳性质控和阴性质控，每孔均设有内标以反映体系对 PCR
反应可能存在的抑制性。
2.2 配制过程
1) 提前 30 分钟将试剂取出，室温融化，短暂震荡，离心数秒。
2) 确定反应数 N，N=待检样本数（n）+质控品数（5）+1。计算加到反应 混合物中的各个试剂的量，计算如下3) 取 1.5ml 无菌离心管配置反应体系，试剂全部加入后震荡混匀，离心数
秒。
4) 然后将上述混合液 23µl/管分装至 PCR 反应管中。
3.加样
取阴性质控品、定量标准品（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）、临床样本 DNA 各 2µl
分别加入 PCR 反应管中，盖紧管盖（避免气泡产生）短暂离心将管壁上的液 体全部甩至管底，然后立即进行 PCR 反应。
4.PCR 扩增程序设置
4.1ABI7500 Real-Time PCR System<Version 1.4 >
1) 打开软件，默认首页面的各选项后点击 Next，进入 Select Detectors 对话 框选择本次实验所需的探针类型（如果供选栏内没有可以新建）：靶基因探针 报告基团（Reporter）为 FAM，淬灭基团（Quencher）为 None；内标探针报 告基团为 HEX，淬灭基团为 None。在左边一栏中选定探针类型后，点击 Add 将 所 选 择 的 探 针 加 入 到 右 栏 (Detectors in Document) 中 ， 右 上 角 passive reference 选择 None。参数设置确认无误后选择 Next，进入 Setup Sample Plate 界面，然后点击 Finish。
2) 进入 Setup 页面后，按照本次实验样本在样品盘上的实际位置，选取相 应孔位，并勾选对应的靶基因和内标模板探针类型。阴性质控品在“Task”一 栏选择“NTC”；定量标准品（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）样本“Task”一栏选择“Standard”， 样本“Task”一栏选择“Unknown”。如果需要编辑样品名，可直接点击相应孔 位后录入，确认后选择 Finish。
3) 进入 Instrument 页面，在此页面中的热循环参数控制面板（Thermal Cycle Protocol）内，设置所需的扩增程序（见下表），并根据实际情况输入扩增体 积（Sample Volume）、选择运行模式（Run Mode: Standard 7500），以及设定 收集荧光的步骤（Data Collection，黄色区域显示）。确认无误后，将结果保 存，点击 Start 开始扩增检测。
4.2Stratagene Mx3000P 型荧光定量 PCR 仪
1) 面板设置：双击“MxPro”图标打开软件，选择 Quantitative PCR（Multiple Standards），点击“OK” ；选中试剂所放的孔位，确认与仪器相对应，随后在 “Well       type”的下拉选框里选择相应的样本类型：待测样本选择“Unknown”、 阴性质控品选择“NTC”、定量标准品选择“Standard”，在“Collect      fluorescence dat”内的“FAM”和“HEX”通道前划“√”；依次选中每一个“Standard”（标准品） 孔，在“Standard      quantity”右侧的选项框内依次选择需要定量的通道“FAM”及 输入相应的标准品浓度。
2) 反应条件设置：单击进入“Thermal Profile Setup”页面，在此页面设置所 需的扩增程序（见下表），确认无误后，将结果保存，点击“RUN”开始扩增检 测：
5. 结果分析条件的设定
5.1ABI 7500 Real-Time PCR System<Version 1.4 >
反应结束后，根据 PCR 仪说明书及荧光曲线进行手动或自动调整基线和阈 值。基线（baseline）的起始点（Start）一般设定在 5～8 之间，终止点（Stop）一般设定在 12～15 之间，阈值线（threshold）通常设定在 1000～5000 之间
（视具体情况而定）。将定量标准品对应的浓度输入仪器软件中，设定之后， 点击分析（Analyse）按键，可以从 Reports 窗口得到各样本的 Ct 值和相应的 初始浓度。
5.2Stratagene Mx3000P 型荧光定量 PCR 仪 反应结束后，根据荧光曲线进行手动或自动调整基线和阈值，手动调整基线 (Non-adaptive baseline)的起始点（Start）一般设定为 5～8，终止点（Stop）
一般设定为 12～15，阈值线（threshold fluorescence）通常设定在 500-2000 之间（视具体情况而定）。依次选中每一个“Standard”（标准品）孔，在“Standard quantity”右侧的选项框内依次选择需要定量的通道“FAM”及输入相应的定量 标准品的浓度。设定之后，可以从“Text report”窗口得到各样本的 Ct 值和相 应的初始浓度。
6. 质量控制
6.1 内标：用于监测 PCR 反应中可能出现的抑制情况。HEX 通道应出现 S
型曲线，Ct 值≤35。
6.2  阴性质控品： FAM 通道无 S 型曲线， 在 Reports 界面 Ct 一栏显示
Undetermined；HEX 通道有 S 型曲线，且 Ct 值≤35.0。
6.3 定量标准品Ⅰ-Ⅳ：用作阳性质控及绘制标准曲线。FAM 通道有 S 型曲 线，且 Ct 值≤35。HEX 通道有 S 型曲线，且 Ct 值≤35.0。
6.4 标准曲线的相关系数 |R| (|r|)  ≥ 0.99，或 R2 (r2)  ≥ 0.98。 以上条件必须在同一次实验中全部满足，否则本次实验结果无效。
【参考值范围】
待检样本测定值显示＜1×103 copies/ml，则报告为“低于试剂盒最低检出 限(1×103 copies/ml）”，测定值在 1×103 copies/ml～5×103 copies/ml 之间的样 本，直接报告所测定的数值，并注明“供参考”，测定值在 5×103 copies/ml～
5×108 copies/ml 之间的样本，直接报告所测定的数值。参考值范围由大量不 同浓度的线性参考品的检测结果确定。
【检验结果的解释】
1. 如果 HEX 通道没有出现 S 型曲线，检测结果无效，应重新检测。高浓度 样本（Ct 值≤25），由于竞争抑制， HEX 通道无 S 型曲线属于正常情况。
2. 如果 HEX 通道出现 S 型曲线，同时 FAM 通道检测无 S 型曲线，则检测
报告为“低于试剂盒最低检出限（1×103        copies/ml）”。
3. 如果 HEX 通道出现 S 型曲线，同时 FAM 通道检测有 S 型曲线，则有如 下解释：
3.1 如果待检样本测定值显示＜1×103 copies/ml，则报告为“低于试剂盒最低 检出限(1×103 copies/ml）”。
3.2 测定值在 1×103 copies/ml～5×103 copies/ml 之间的样本，直接报告所测
定的数值，并注明“供参考”。
3.3 测定值在 5×103 copies/ml～5×108 copies/ml 之间的样本，直接报告所测 定的数值；
3.4 测定值大于 5×108copies/ml 的样本，建议将样本稀释至线性范围后重新 测定，并根据下面公式计算样本浓度，结果注明为可报告数值。 可报告数值(最终样本浓度)=稀释后浓度×稀释倍数
稀释倍数=(样本量+稀释液量)/样本量
4 最适样本类型、感染类型及感染后的最高病毒滴度时间未经验证，因此， 在同一患者分次、多部位采集样本可能会避免假阴性。
5 不合理的样本采集、转运及处理，样本中的病毒滴度过低均有可能导致假 阴性结果。
6 病毒检测靶序列的变异会导致假阴性结果。
7      本检测结果仅供临床参考，如需确诊请结合临床症状和其他检测手段。
EB病毒核酸检测试剂盒PCR荧光探针法【检验方法的局限性】
1.    当样本中被检测核酸浓度低于最低检测限 1×103 copies/ml 时，可能会导致假阴性结果。

2. 扩增产物的污染和核酸提取中标本间的交叉污染，很容易出现假阳性结 果。因此，PCR 临床应用必须要有严格的实验室分区、实验室管理和 质量控制措施。
3.    样本中残留的蛋白质成分对 PCR 扩增有抑制作用，在样本处理的取上 清时应避免吸入白色沉淀物质。
【产品性能指标】
1 分析灵敏度：根据产品分析性能评估结果，本试剂盒的分析灵敏度为 1×103 copies/ml。
2 分析特异性：
a.对于可能存在检测干扰的病原体：人巨细胞病毒、BK 病毒、JC 病毒、梅 毒、甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ型、单 纯疱疹病毒Ⅱ型、水痘带状疱疹病毒(VZV)、疱疹病毒 6 型、疱疹病毒 7 型、
结核杆菌、人乳头瘤病毒 HPV(6, 11, 16, 18)、沙眼衣原体、淋球菌、解脲脲
原体、肺炎支原体（MP）、肺炎衣原体（CP）、肠道病毒 71 型（EV71）、柯 萨奇 a16 型(CA16)等病原体阳性样本，本试剂盒检测结果均为阴性。
b. 干扰物质：样本中常见干扰物质高浓度的胆红素（279.8μmol/L）、甘油三
酯（62.33 mmol/L）、血红蛋白（167g/L）对 PCR 结果无明显干扰。
3 精密度：同一批试剂对样本进行 10 次重复检测，检测浓度对数值的变异 系数 CV≤5%（n=10）。
4 线性检测范围：5×103 copies/ml~5×108 copies/ml。 5 临床试验：
临床实验结果显示：本试剂盒的灵敏度为 99.52%，特异性为 98.08%。
【注意事项】
1. 实验前请仔细阅读本说明书。
2. 本品仅用 于体外诊断。
3. 使用本产品时，应遵循临床基因扩增实验室的技术规范进行操作。
4. 请自备移液器，振荡器，离心机，无菌且带滤芯吸头、离心管、PCR 反应管，及无粉一次性乳胶手套。
5. 样本处理在生物安全柜内进行操作，防止污染环境和保护操作者。
6. 样本操作和处理需符合相关法规要求：卫生部《微生物生物医学实验室 生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。
7. 实验后的废弃物品，如吸头、扩增产物等需进行无害化处理后方可丢弃。
8.试剂盒中的阳性质控品是体外纯化的质粒，无传染性，但操作时应仍视为 传染性物质进行处理。 
9.样本核酸提取完毕后，建议立即进行检测，否则请保存于-20℃，并且在24 小时内进行检测。
10. 实验完毕后使用 10%次氯酸或 75%乙醇处理操作台面和移液器、离心 机、PCR 仪表面，然后紫外灯照射 25-30 分钟。
11. 不同批号试剂盒中各组份不可以互换，请在有效期内使用本试剂盒，不
使用本试剂盒中的组分进行实验可能会导致错误的结果。
【参考文献】
1Ruiz G, Peña P, de Ory F et al. Comparison of commercial real-time PCR assays for quantification of Epstein-Barr virus DNA.J Clin Microbiol,2005 May;43(5):2053-7
2E. Leung,B.K. Shenton,G.Jackson et al.Use of real-time PCR to measure Epstein–Barr virus genomes in whole blood.Journal of Immunological Methods, 2002;270: 259–267
3 刘冬.小儿EB病毒感染临床表现的多样性.中外医疗，2010，29: 93-95

EB病毒核酸检测试剂盒PCR荧光探针法