基因敲除/敲入/沉默细胞的建立

提供商 ：北京百奥利德生物

服务名称 ：基因相关的细胞构建服务

细胞基因敲除/敲入服务

基因敲除/敲入细胞系建立
    CRISPR Cas9 是一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定基因修饰的技术，是细菌和古细菌在长期应对病毒和质粒不断攻击而演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制，其原理是Cas9蛋白通过导向性RNA（guide RNA，sgRNA）识别特定基因组位点并进行剪切， 它能够共定位 RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的 Cas9(Cas9 nuclease-null)融合，并表达适当的 gRNA，即可靶定任何 dsDNA 序列，而 RNA 可连接到gRNA 的末端，不影响 Cas9 的结合。因此，Cas9 能在任何 dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及 RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。目前已被广泛应用于基因组的精确编辑修饰，尔丙生物可以提供基于CRISPR / Cas9系统的基因敲除稳定细胞系以及基因敲除小鼠服务。

服务流程

1. 细胞分型；
2. 细胞预实验；
3. 针对敲除/敲入目的基因设计合适靶点；
4. 构建 cas9-gRNA表达质粒并测序验证；
5. 目的细胞培养，并将构建好的表达质粒转染细胞；
6. 抗性筛选获得单克隆细胞；
7. 基因敲除细胞系的检测。

客户提供
1. 待敲除目的基因信息，即靶向DNA信息；
2. 需构建敲除株的细胞信息，如客户提供细胞，新鲜细胞，灌满培养基运输，或细胞冻存管，干冰运输。

结果交付

1. 基因敲除稳定细胞株；
2. 验证报告；
3. 详细实验报告（试剂耗材、仪器设备、操作）及相关原始数据。

基因沉默细胞的建立

    RNA干扰技术理论上可以在任何动物模型上进行。通过制各针对靶基因mRNA不同区段的siRNA转基因动物，有可能获得对靶基因不同程度的沉默效果，从而可以模拟数量遗传性状。这一优点是基因敲除技术所不具备的。此外，这种技术不需要复杂的过程，能够在数周内花费只有基因敲除动物的很少一部分就可以对基因功能进行研究。
RNA干扰基因敲除动物模型的问题在于siRNA载体导入的成功率较低，所涉及的dsRNA不能有效地沉默靶基因的转录。此外，有研究表明导入大量shRNA会影响内源性miRNA的水平和活性。

技术原理
dsRNA或pre-miRNA被导入细胞后，能够被一种特异的核酸内切酶（Dicer）识别并切割成为小片段，这些片段在RNA解旋酶的作用下解链。继之反义链在与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-Induced Silencing Complex，RISC），RISC与mRNA同源区进行特异性结合，若miRNA与mRNA的结合位点完全配对，则切割mRNA；若miRNA与mRNA的结合位点不完全配对，则抑制mRNA的翻译。

应用领域
1. 基因功能研究，活体生物上进行基因功能研究与验证；
2. 基因治疗，精确定位，靶向治疗；
3. 构建动物模型；
4. 改造和培育新品种。

服务流程

1. 细胞分型；
2. 细胞预实验；
3. 针对沉默基因设计合适靶点；
4. 构建慢病毒；
5. shRNA、miRNA功能验证实验；
6. 慢病毒包装；
7. 基因沉默细胞系的建立；
8. 细胞基因沉默检测。

客户提供
1. 目的基因序列；
2. 其他个性化定制要求，譬如启动子、荧光标记基团、Tag标签等选择要求。

交付内容

1. 构建完好的带有目的基因的载体；
2. 病毒滴度测定的荧光显微照片和流式细胞数据；
3. 基因沉默效果验证结果。