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文献和实验
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库存 :大量
英文名 :Seamless Cloning Kit
保质期 :一年
供应商 :上海联迈生物工程有限公司
保存条件 :-20℃保存
规格 :5次
Seamless Cloning Kit (无缝克隆试剂盒, 试用装)产品编号 | 产品名称 | 产品包装 | 产品价格 |
LM7010FT | Seamless Cloning Kit (无缝克隆试剂盒, 试用装) | 5次 | 1元 |
Ligase)活性的重组酶(assembly enzyme),通过同源重组的方法可以将一个或多个DNA片段按照预定方向、快速、高效和精确
地插入到线性化载体中,并且最终构建的克隆没有任何额外的碱基序列,因此被称作“无缝克隆”。
和传统的基因克隆方法相比,本试剂盒的无缝克隆方法有多方面的突出优点:(1) 最终构建的克隆没有任何额外的碱基序列,因此是真正的"无缝克隆";(2) 可通过一个反应将一个或多个片段快速、定向地插入到载体的任何位置;(3) 待插入的PCR扩增产物无须酶切;(4) 插入片段的大小范围宽,从20bp左右的小片段到10kb左右的大片段都可以成功插入;(5) 可通过PCR扩增获得线性化载体,因此限制性内切酶消化并不是克隆所必须的;(6) 酶催化的重组连接反应非常快速和高效,对于一个片段的插入仅需50℃处理15分钟;对于三个片段的插入仅需50℃处理30分钟,而对于5个片段的插入也仅需50℃处理约60分钟;(7) 只有插入片段和线性化载体的末端才能发生同源重组,可以有效避免非特异性的同源重组;(8) 阳性克隆比例高,单个DNA片段克隆的阳性率几乎为100%,三个片段的克隆阳性率约为70-80%。
本无缝克隆试剂盒操作非常简单。本试剂盒进行基因克隆时没有酶切位点的限制,仅需在载体的预定克隆位点通过酶切进行线性化或通过PCR的方法直接制备线性化的载体,在插入片段的两个PCR引物的5' 端引入与载体克隆位点两端完全一致的
15~25bp的重叠序列。重组反应可以在50℃快速进行,3-4小时内即可完成从DNA样品的PCR扩增、纯化、重组、到转化涂板的全部操作。其中PCR反应约2-3小时,PCR产物纯化约20分钟,重组反应15分钟,转化涂板约40分钟,共计约3-4小时即可完成。
联迈生物无缝克隆试剂盒的工作原理示意图请参考图1。
图1. 联迈生物无缝克隆试剂盒的工作原理图。重叠区域(overlap region)的DNA序列完全一致,通常长度为15-25bp。不同颜
色的重叠区域代表不同的重叠序列。在插入2个或以上片段时,不同的重叠序列可以确保待插入片段有序地插入到线性化的载体(linearized vector)中。
本试剂盒用于一个1100bp片段的克隆和三个不同的1100bp片段的克隆,其重组反应产物转化DH5α感受态细胞后涂板获得的LB平板的实测效果参考图2A,菌落PCR鉴定结果参考图2B。
图2. 本试剂盒用于无缝克隆的实测效果。A. 本试剂盒反应产物转化感受态细菌DH5α后涂板获得的LB平板效果图。在20μl反应体系中,将双酶切线性化的载体pUC18 (Linearized pUC18),与通过PCR扩增的含有重叠序列的插入片段(DNA fragment, 1100bp)混合(pUC18载体与PCR片段的摩尔比为1:3);或者与3个有适当重叠序列的不同的1100bp片段混合,pUC18载体与PCR片段的摩尔比为1:1:1:1,然后加入10μl的2X Seamless Cloning Mix,并用水补至20μl,50℃反应15min(插入一个片段)或
30min(插入三个片段)。反应结束后,将反应产物放置在冰上5min,取5μl转化到100μl的DH5α感受态细菌中。对照组中只加入线性化的载体pUC18,同时也在50℃反应15min。实验结果表明,插入片段数目越多转化后得到的克隆数越少。B.菌落PCR鉴定用本试剂盒构建得到的克隆。实验结果表明,插入1个片段时的阳性率基本上为100%,插入3个片段时的阳性率约为70%左右。
包装清单:
产品编号 | 产品名称 | 包装 |
LM7010FT-1 | 2X Seamless Cloning Mix | 50μl |
LM7010FT-2 | Linearized pUC18 (50ng/μl) | 3μl |
LM7010FT-3 | DNA fragment (1100bp, 60ng/μl) | 3μl |
LM7010FT-4 | Nuclease free water | 50μl |
— | 说明书 | 1份 |
-20℃保存,一年有效。
注意事项:
单个片段的PCR产物进行重组反应时,如果PCR条带单一,可以无须纯化并直接进行重组反应,但PCR产物的体积不得超过重组反应体系的20%,并且重组效率通常会低于纯化后的PCR产物。
对于多个片段的重组反应,重组效率通常会低于单个片段的重组效率,建议胶回收纯化后再进行重组反应。对于3个以上片段的重组反应或重组片段大于5kb时,强烈建议在胶回收后再进行重组反应。通常胶回收后,重组效率可提高2-10倍。
单片段和线性化载体重组时,摩尔比至少为2:1。多片段和线性化载体重组时,各个片段和线性化载体的摩尔数宜保持一致。
本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
上海联迈生物工程有限公司
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