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文献和实验
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库存 :631
英文名 :IRF1 GFP Reporter Plasmid
保质期 :长期
供应商 :北京百奥莱博科技有限公司
保存条件 :-20℃
特别声明:本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品,严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。
北京百奥莱博专业生产销*(代"售")IRF1-GFP报告基因质粒北京厂家,我公司供应的细胞生物学试剂品类齐全,且具有优势价格,欢迎新老客户垂询订购。
名称:IRF1-GFP报告基因质粒北京厂家
英文名:IRF1 GFP Reporter Plasmid
品牌:百奥莱博
规格:1μg
IRF1-GFP报告基因是用于检测IRF1转录活性水平为目的的报告基因。IRF1(Interferon Regulatory Factor 1)是IRF家族中最早被发现的核转录因子,具有广泛的生物学功能,它可以调节干扰素系统,抑制细胞生长,抑制肿瘤形成。
IRF1-GFP报告基因主要用于检测细胞中的Interferon Regulation信号通路、药物研究以及基因过表达和RNAi的表型分析等。
pGMIRF1-GFP是我公司改造后的哺乳动物真核表达载体,在其多克隆位点插入了多个IRF1结合位点,可以高效地检测IRF1的激活水平。由于载体采用了GFP作为报告基因,更便于后续的检测。同时,对载体中预测出的其它转录因子以外的结合位点进行了适当的突变,增加了质粒的转录因子结合特异性。另外,由于质粒体积减小,使得IRF1-GFP报告基因更易于转染。
质粒图谱
pGM IRF1 -GFP质粒测序引物
5’-TAGCAAAATAGGCTGTCCC-3’
使用说明
pGMIRF1-GFP可以采用常规转染方法转染哺乳动物细胞。
注意事项
1)本质粒未经我公司允许不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人实验室以外的任何人或单位。
2)为了您的健康,实验操作时请穿实验服和带一次性手套。
储存条件:-20℃。
欲咨询购买IRF1-GFP报告基因质粒北京厂家,请致电北京百奥莱博科技有限公司,为您提供最全面周到的产品服务,除此之外,我公司正在促销以下产品:
·热启动高保真酶
编号:SY0038
英文名称:HotStart Pfu DNA Polymerase
规格:100U
HotStart Pfu DNA Polymerase在Pfu DNA Polymerase的基础上添加了在常温下能够抑制5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性的两种单克隆抗体,可进行高特异性的热启动(Hot Start)PCR,扩增产物为平端。Pfu DNA Polymerase是经过基因工程改造的,新一代超保真DNA聚合酶,具有极高的扩增效率和广泛的模板适应性,可用于几乎所有PCR反应。其行进性 (processivity)得到了大幅度提升,即使是非常复杂的模板,也能准确快速的完成反应。其错配率是普通Taq酶的1/52,是Pfu酶的1/6;且扩增速度可以达到15秒/kb。
本产品中附带的5×HS Pfu buffer对于简单或复杂模板、短片段或长片段PCR扩增都具有良好的适应性。缓冲液中已经含有10 mM Mg2+ (1×终浓度为2 mM),可以使用产品中提供的DMSO/MgSO4对反应体系进行优化。另外,产品中附带的PCR Enhancer可有助于高GC含量片段的扩增。
产品组份:
5×HS Pfu buffer(with 10 mM MgSO4):1.25 ml
25 mM MgSO4:1 ml
dNTP Mix(10 mM each):100 μl
HS Pfu DNA Polymerase(1 U/μl):100 μl
5×PCR Enhancer:500 μl
DMSO:100 μl
10×Loading buffer:1.25 ml
活性定义:用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物,74℃ 30分钟内,摄入10 nmol的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为1个活性单位(U)。
储存条件:-20℃
质量控制:
核酸外切酶残留检测:10 U本品和0.6 μg λ-HindⅢ在74 ºC下孵育1小时,DNA的电泳谱带不发生变化。
核酸内切酶残留检测:10 U本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在74 ºC下孵育1小时,DNA的电泳谱带不发生变化。
大肠杆菌残留DNA检测: 50 μl体系中,加入2U本品,以ddH2O为模板,扩增E.coil 16s rDNA基因。35个循环后扩增产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳,EB染色,无扩增条带。
功能检测1:50 μl PCR体系中加入1U本品,以100 ng人基因组DNA为模板扩增α-1-antitrypsin基因。30个循环后取10% PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳,EB染色,观察到单一的8.2 kb条带。
功能检测2:50 μl PCR体系中加入1U本品,以10 ng λDNA为模板扩增30个循环,取10% PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳,EB染色,观察到单一的15 kb条带。
使用方法:
1. 所有操作请在冰上进行,各组分解冻后请充分摇匀。为了防止HS Pfu DNA Polymerase的校对活性降解引物,请将聚合酶最后加入反应体系中。各组分使用完毕后及时放回-20℃。5×HS Pfu buffer请勿长时间敞口放置。
ddH2O | to 50 μl |
d5×HS Pfu buffer (with 10 mM MgSO4) | 10 μl |
d25 mM MgSO4a | optional |
ddNTP Mix(10 mM each)b | 1 μl |
dDMSOc | optional |
d5×PCR Enhancerd | optional |
d模板DNAe | optional |
dForward Primer(10 μM) | 2μl |
dReverse Primer(10 μM) | 2 μl |
HS Pfu DNA Polymerase(1 U/μl)f | 1 μl |
【注】:
a. 对于大多数PCR反应,Mg2+最佳终浓度为1.5-2 mM。体系中已含有终浓度为2 mM Mg2+,如有需要,可用25 mM MgSO4,以0.2-0.5 mM为间隔向上摸索Mg2+最佳使用浓度。
b. 请勿使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板。
c. 扩增子GC含量>60%时加入终浓度3%的DMSO有可能会有助于扩增。
d. 推荐仅当扩增子GC含量>60%且优化条件也无法正常扩增时使用;可能会降低保真度。
e. 不同模板最佳反应浓度有所不同,下表为50 μl反应体系推荐模板使用量:
模板种类/扩增长度 | <1 kb | 1 kb~10 kb | >10 kb |
基因组DNA | 50 ng~250 ng | 100 ng~300 ng | 150 ng~400 ng |
质粒或病毒DNA | 10 pg~20 ng | 10 pg~20 ng | 1 ng~30 ng |
cDNA | 1~5 μl(不超过PCR反应总体积的1/10) |
f. 推荐的酶的终浓度为1U/50 μl反应。然而,根据扩增子的长度和复杂程度不同,可将HS Pfu DNA Polymerase在0.5-2U/50 μl反应之间进行优化。但请勿超过2U/50 μl,尤其当扩增子长度大于5 kb时。HS Pfu DNA Polymerase具有较强的校对活性。如扩增产物需要进行TA克隆,加A之前必须进行DNA纯化。
2. 推荐PCR反应条件:
循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性a | 95℃ | 30 sec~3 min | 1 |
变性b | 95℃ | 5~10 sec | 25~35循环 |
退火c | 45℃~72℃ | 10~30 sec | |
延伸d | 72℃ | 15~30 sec/kb | |
彻底延伸 | 72℃ | 5~10 min | 1 |
【注】:
a. 推荐大多数模板的预变性温度为95℃,时间为:质粒或病毒DNA,30 sec,基因组2 min,cDNA 3 min;对于高GC含量模板,预变性温度需提升至98℃,变性时间为2~4 min;对于超过10 kb的扩增子,预变性温度需降低至92℃,变性时间不超过2 min。
b. 对于大多数模板在95℃变性时间设为5~10 sec即可。对于高GC含量模板,变性温度需提升至98℃;对于超过10 kb的扩增子,变性温度需降低至92℃,并延长变性时间至15 sec。
c. HS Pfu DNA Polymerase能够促进模板和引物高效退火。一般来说,退火温度设置为引物Tm值±3℃范围内之间即可。如果需要,可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的最适温度。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状。因此,推荐退火时间设置为10 sec即可。对于一些困难模板,退火时间可在10~30sec之间调整。
d. 对于大多数扩增反应,延伸过程可在72℃进行。对于超过10 kb的扩增片段,需降低延伸温度至68℃。延伸时间取决于扩增片段的长度和模板的复杂性。使用质粒等复杂程度较低的DNA做模板时,可使用15 sec/kb的延伸时间;使用基因组
cDNA等复杂程度较高的DNA做模板时,延伸时间应为30 sec/kb。太长的延伸时间会导致非特异性扩增增加,因此延伸时间请勿超过30 sec/kb。
3. 长片段PCR指南:
*使用高质量的模板;
*使用长引物。将引物加长至Tm值68~72℃,把退火/延伸温度合并为68℃。这样可以显著提高扩增特异性;
*适当提高酶量,但50μl反应体系内不要超过2 U;
*添加DMSO,以1%的浓度递增。调整范围为0%~6%;
*推荐反应条件设置:
循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 92℃ | 2 min | 1 |
变性 | 92℃ | 5~10 sec | 25~35循环 |
延伸 | 68℃ | 15~30 sec/kb | |
彻底延伸 | 68℃ | 5~10 min | 1 |
4. 高GC含量模板PCR指南:
*使用高质量的模板;
*提高变性温度至98℃;
*添加DMSO,以1%的浓度递增。调整范围为0%~8%;
*添加5×PCR Enhancer;
*推荐反应条件设置:
循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 98℃ | 3 min | 1 |
变性 | 98℃ | 10 sec | 25~35循环 |
退火 | 45℃~72℃ | 10~30sec | |
延伸 | 72℃ | 15~30 sec/kb | |
彻底延伸 | 72℃ | 5~10 min | 1 |
引物设计注意事项:
1)引物3’端最后一个碱基最好为G或者C;
2)引物3’端最后8个碱基应避免出现连续错配;
3)引物3’端尽量避免发夹结构出现;
4)引物的Tm值调整至55℃-65℃之间。
5)引物额外附加序列,即与模板非配对序列,不应参与引物Tm值计算;
6)引物的GC含量控制在40%-60%之间;
7)正向引物和反向引物Tm值以及GC含量尽可能一致。
IRF1-GFP报告基因质粒北京厂家关键词:IRF1 GFP Reporter Plasmid,SY0171,IRF1-GFP报告基因质粒
·BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)
编号:SY0298
英文名称:BCA Protein Quantification Kit
规格:500T
该BCA蛋白浓度测定试剂盒可用于比色皿法检测,也可用于微孔板法检测。前者虽需较大量(100μl)的蛋白样品,但由于其在检测中使用蛋白样品与BCA工作液的比率为1:20(v/v),从而降低干扰物质带来的影响。后者操作简单方便,仅需少量(10-25μl)的蛋白样品。不过,由于其在检测中使用蛋白样品与BCA工作液的比率为1:8(v/v),某种程度上限制干扰物质的承受浓度以及降低最低检测水平。我司提供三种规格的BCA蛋白浓度检测试剂盒,比色皿法分别可做50次,250次,500次。酶标法分别可做500次,2500次,以及5000次。
BCA(Bicinchoninic acid)法是目前应用比较广泛的蛋白质浓度测定方法。基于双缩脲反应,即在碱性环境下蛋白质将Cu2+还原成Cu+,产生一种紫蓝色复合物,在562nm处有高的吸光值,该反应产物的量与蛋白质浓度成正比。BCA蛋白浓度测定法实现了蛋白质浓度测定的简便、灵敏、快速和稳定性。试剂盒中提供的蛋白标准品为用户制作标准曲线提供了便利。
产品特点
1)灵敏度高,最小检测蛋白量可达0.2μg,检测浓度下限达到10μg/ml。
2)速度快,比一般的BCA蛋白浓度测定试剂盒显色所用时间短。比传统的Lowry法检测速度约快4倍。
3)线性范围广,20-2000μg/ml浓度范围内有较好的线性范围。
4)不受大部分样品中的化学物质的影响,可以兼容样品中5%的SDS,5%的Triton X-100,5%的Tween 20,60,80等。
储存条件:室温,有效期一年。
注意事项
1)使用BCA蛋白测定法测定时颜色会随着时间的延长不断加深,并且显色反应的速度和温度有关,因此需注意保持定时和定温,以确保精确定量。
2)低温或长期保存,若发现BCA试剂A或者试剂B有沉淀发生。请37ºC温育并伴随搅拌促使其充分溶解。如发现细菌污染,则应丢弃,避免对实验结果造成影响。
3)实验操作规范,提高上样量的精确度。
4)每次测定都需做相应的标准曲线,因为显色反应与温度和时间的变化有关,精准的蛋白定量宜每次都做标准曲线。
操作方法
一、配制标准品和工作液
1. 配制BSA标准品体系
注:标准品稀释液为蛋白样品的溶解液,原则上蛋白样品在什么溶液中,标准品也宜用什么溶液稀释。但也可用0.9%的NaCl或1×PBS进行稀释。
BSA标准品体系配制可参考表一。
Vial | 稀释液体积(μl) | 2mg/ml BSA体积(μl) | BSA终浓度(μg/ml) |
A | 0 | 100 | 2000 |
B | 25 | 75 | 1500 |
C | 50 | 50 | 1000 |
D | 125 | 75 | 750 |
E | 150 | 50 | 500 |
F | 350 | 50 | 250 |
G | 375 | 25 | 125 |
H | 395 | 5 | 25 |
I | 400 | 0 | 0=Blank |
表一BSA标准品体系配制(微孔板检测,线性范围20-2000μg/ml)* |
*如用比色皿检测,每管需加100μl标准品,按3个重复计算,每个浓度至少需配制300μl。
2. 配制BCA工作液
1)计算所需要的总BCA工作液体积。
总BCA工作液体积=(标准品+待测样品)×重复数×每个样品所需要的BCA工作液
注:比色皿检测时每个样品加2.0ml BCA工作液,微孔板检测每个样品加200μl BCA工作液。
2)配制BCA工作液:50体积的BCA试剂A中加入1体积的BCA试剂B(A:B=50:1) ,充分混匀。
注:BCA试剂B加入BCA试剂A中后,迅速浑浊,通过混匀后立即变澄清。BCA工作液装入密封容器内,室温条件24h稳定。
二、检测方法
1. 比色皿检测方法(样品:BCA工作液=1:20)
1)各取100μl标准品和待测样品加入到反应管中。
2)每管加入2.0ml BCA工作液,混匀。37℃孵育30min。
注意:也可室温孵育2h,或者60℃孵育30min。BCA检测蛋白浓度,延长孵育时间会加深颜色反应。升高温度会加快显色反应。但是温度升高和时间延长会降低检测下限,以及降低工作线性范围。若蛋白浓度很低,可在较高温度孵育或者适当延长孵育时间。
3)冷却到室温。在分光光度计上进行检测,设定波长为562nm。用装满水的比色皿对仪器校零。然后在10分钟内对所有样品读数。
注意:由于BCA反应达不到真正的反应终点,即使温度降低至室温生色反应液会继续。但是,由于室温下生色比率相当低,因此若是10min内能对所有的样本进行562nm吸光度的测试,不会导致明显错误。
4)根据BSA标准品的吸光度(减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数),绘制标准曲线(X-蛋白浓度ug/ml;Y-最终的OD562nm)。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。
2. 微孔板检测方法(样品:BCA工作液=1:8)
1)各取25μl标准品和待测样品加入到微孔板中。
注:样品与工作液比例为1:8,若样品有限,可使用10μl标准品和待检测样品进行检测(即1:20),这时试剂盒的检测范围为125-2000μg/ml。
2)每孔加入200μl BCA工作液,振荡30s充分混匀。盖上微孔板,37℃孵育30min。
3)冷却到室温,在酶标仪上的540~595nm波长范围处检测吸光度,其中562nm波长为最佳。
注意:
a)由于酶标板的光径比比色皿短,使得酶标板检测需要更好的样品:BCA工作比率来获得相同的检测灵敏度。若使用高于562nm的检测波长,建议延长孵育时间到2h。
b)延长孵育时间或者提高样品:BCA工作比会增高每个孔的OD562nm净值,并且降低检测下限和工作线性范围。
4)根据BSA标准品的吸光度(减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数),绘制标准曲线(X-蛋白浓度ug/ml;Y-最终的OD562nm)。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。
附录:
表:BCA蛋白浓度测定的兼容性
名称 | 耐受浓度 |
Sodium bicarbonate | 100 mM |
Sodium phosphate | 25 mM |
2-Mercaptoethanol | 0.01% |
Glycercol (pure) | 10% |
Glycine-HCl, pH 2.8 | 100 mM |
HEPES | 100 mM |
Hydrochloric acid | 100 mM |
Leupeptin | 10 mg/L |
Nickel chloride (in TBS, pH8.0) | 10 mM |
Nonidet P-40 (NP-40) | 5% (w/v) |
Octyl β -glucoside | 5% (w/v) |
Potassium thiocyanate |
3.0 M |
SDS | 5% |
Sodium acetate, pH 4.8 | 200 mM |
Sodium azide | 0.20% |
Sodium hydroxide | 100 mM |
Sucrose | 40% |
Triton X-100 | 5% |
Triton X-114, X-305,X-405 | 1% |
Tween-20, Tween-60, Tween-80 | 5% |
Zwittergent | 1% |
ACES, pH 7.8 | 25 mM |
Acetone | 10% |
Acetonitrile | 10% |
Ammonium sulfate | 1.5 mM |
Aprotinin | 10 mg/L |
Bicine, pH 8.4 | 20 Mm |
Bis-Tris, pH 6.5 | 33 mM |
Borate, pH 8.5 | 50 mM |
Brij-35 | 5% |
Brij-52 | 1% |
Brij-56, Brij-58 | 1% |
BugBuster protein Extraction Reagent |
no interference (undiluted) |
Calcium chloride (in TBS, pH 8.0) | 10 mM |
CelLytic B Reagent | no interference (undiluted) |
Cesium bicarbonate | 100 mM |
CHAPS | 5% |
Cobalt chloride (in TBS, pH 8.0) | 0.8 mM |
CytoBuster Protein Extraction Reagent |
no interference (undiluted) |
Deoxycholic acid | 5% |
Dithioerythritol (DTE) | 1 mM |
Dithiothreitol (DTT) | 1 mM |
DMF | 10% |
DMSO | 10% |
EDTA | 10 mM |
EPPS, pH 8.0 | 100 mM |
Ethanol | 10% |
Ferric chloride (in TBS, pH 8.0) | 10 mM |
Glucose | 10 mM |
Glycerol | 10% |
Guanidine-HCl | 4 M |
Imidazole, pH 7.0 | 50 mM |
MES, PH6.1 |
100mM |
Methanol | 10% |
MOPS, pH7.2 | 100mM |
N-Acetyglucosamine(10mM)in PBS, pH7.2 | 10mM |
Octyl β- thioglucpyranoside |
5% |
PIPES, pH6.8 | 100mM |
PMSF | 1 mM |
PopCulture Reagent (Cat. No. 71092) | no interference (undiluted) |
Reportasol Extraction Buffer | no interference (undiluted) |
Sodium chloride | 1 M |
Sodium citrate, pH 4.8 or pH 6.4 | 200 mM |
Sodium ortho-vanadate in PBS, pH7.2 | 1mM |
Span 20 | 1% |
TBS (150 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8.0) | no interference (undiluted) |
Thimerosal | 0.01% |
TLCK | 0.1mg/L |
TPCK | 0.1mg/L |
Tricine, pH 8.0 | 25 mM |
Triethanolamine, pH 7.8 | 25 mM |
Tris | 250 mM |
Tris(hydroxypropyl)phosphine (THP) | 1 mM |
Urea | 3M |
Zinc chloride (in TBS, pH 8.0) | 10 mM |
IRF1-GFP报告基因质粒北京厂家关键词:IRF1 GFP Reporter Plasmid,SY0171,IRF1-GFP报告基因质粒
BTN130509 磁珠血液DNAOUT MAG Blood DNAOUT
NF-210 羊抗人C4血清
ARB10969 人免疫球蛋白G Fc段受体I(FcγRI/CD64)血清中含量检测 Human receptorifor the fc region of immunoglobulin g,fcγri ELISA KIT
TEN缓冲液(1×,pH8.0) 500ml
F030435 胶体金标记山羊抗鸡IgY IgG抗体 Polyclonal Goat Anti-Chicken IgY(IgG)*GOLD
ARB14193 山羊蛋白聚糖(PG)酶免分析
PY01-140 蚕蛹蛋白胨 250克
NF-204 羊抗人Alb血清
己糖激酶 Sepharose CL-4B 9001-51-8
9000-70-8 明胶 Gelatin
F030639 FITC标记山羊抗人IgG Fab抗体 Polyclonal Goat Anti-Human IgG Fab*FITC
硫*(代"酸")葡聚糖 Sodium iodide 9011-18-1
硫*(代"酸")链霉素溶液(10mg/ml) Streptomycin 10mg/ml 10ml
碳酸铈 HEPPSO sodiu*(代"m") salt 54451-25-1
北京百莱博科技有限公司专业生产报告基因检测产品,欢迎来电咨询选购IRF1-GFP报告基因质粒北京厂家。
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