乳鼠心肌细胞培养（威斯腾生物-中关村生物医学研发检测共享平台！）

服务名称 ：乳鼠心肌细胞培养

提供商 ：威斯腾生物

一、目的

正确使用心肌组织中分离心肌细胞的方法和程序，掌握组织取材、剪切、细胞分离、混匀、计数、接种和器械使用等的操作要领、方法，按照无菌操作技术进行乳鼠心肌细胞培养。

二、原理

乳鼠心肌细胞属于原代生长细胞。心肌组织中心肌细胞约占50%，非心肌细胞占50%，用酶消化法将心肌组织碎块经纯化分离成单个心肌细胞，用培养基制成心肌细胞悬液，内心肌细胞可达95%，在体外适宜条件下，使心肌细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。在乳鼠心肌细胞培养实验中能直接观察到培养心肌细胞生命活动的动态过程，还可利用电镜手段、同位素标记、放免法和免疫组化法来研究细胞形态结构及细胞内化学物质的分布。

三、主要操作规程

（一）试剂配制

1、D-Hanks 液(g/L)： KCl 0.40，KH2PO4 0.06，NaCl 8.00，NaHCO3 0.35，Na2HPO4·12H2O 0.13，酚红0.02。以1mol/L HCl 或1mol/L NaOH 调整溶液pH 值至7.0-7.2，每瓶100 mL 分装，4℃冷藏备用。

2、0.125%胰蛋白酶：0.125 g 胰蛋白酶干粉溶于100mL D-Hanks 液中，搅拌2h，4℃冰箱放置过夜，每瓶8mL 分装，-20℃冷藏备用。

3、DMEM 培养基：DMEM 干粉(1L 量)溶于500mL 三蒸水中，充分搅拌溶解，将3.0g NaHCO3 溶于少量三蒸水中，混合，定容至1L 后调pH 值至6.8-7.0，每瓶80mL 分装，4℃冷藏备用。

4、双抗液配制：100 万U 硫酸链霉素溶于l0mL Hanks 液中，80 万U 青霉素粉溶于8mL 上述硫酸链霉素的Hanks 液中，配成每毫升含青霉素、链霉素各10 万U 的母液。使用时，在100 mL 培养基中加母液0.1 mL，则培养基内青霉素、 链霉素终浓度为100 U/mL。

5、胎牛血清：胎牛血清在56℃水浴中灭活30min，青霉素小瓶分装，-20℃保存备用。将20mL 胎牛血清加入80mL DMEM 中，配成终浓度为含20%胎牛血清的DMEM。

6、PBS 缓冲液：KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，NaCl 8.0g，Na2HPO4·12H2O 2.08g溶于1000mL 三蒸水中。

（二）消毒准备

先检查显微镜、磁力搅拌器及离心机是否好用，提前三小时把小牛血清、胰酶、抗生素取出解冻。其余未冻药品提前20分钟取出来与室温平衡。新洁尔灭（0.1％）纱布（用10 mL 5％的新洁尔灭加水至500 mL）消毒地面（1：500的84液），用酒精棉球擦拭超净工作台台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开风机吹至实验结束。

（三）细胞培养

1、把两个5 mL注射器分别插入DMEM和胰酶中，分别向两个圆皿中加入5 mL 的DMEM培养液。用一把大镊子从鼠盆里取出一只生后2~3天的SD大鼠放入0.1％新洁尔灭浸泡一下后拿出放在泡沫板上，用针头把鼠固定（位置摆正），用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘，取一把小剪子及小镊子开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，后换另一把小剪子和镊子在剑突处正中线稍偏左开胸取心。

2、取出的心放在刚才准备的一个装有DMEM的圆皿中再取下一只。重复以上过程。（鼠全部杀死后，把取鼠镊及泡沫板、新洁尔灭缸等拿出台面。消毒、清洁，铺纱布、换手套。

3、用第三副剪子和镊子把圆皿中的心脏周边的血凝及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好DMEM的圆皿中。抽取5 mL的胰酶，然后将其中少许放入50 mL的小烧杯中，大部分倒入三角烧瓶中。用第四副剪子将烧杯中的心脏剪成 1 mm3的碎块，倒入三角烧瓶中（可用剪刀刮入），再用剩余胰酶刷净烧杯。

4、把温度计和三角烧杯放入250 mL烧瓶中，（事先调好水量，多会没过三角烧杯，少温度会不均匀）。打开磁力搅拌器电源，调温度（使-缓慢加到34~35 ℃） 和转速（转速不可过快，否则会打碎细胞，基本上标志为平行，一定要注意监控）。

5、温度达到34℃时开始计时，第一次为10分钟，以后可为8分钟，事情况而定。在此期间，在试管架上摆上5、6个离心管，标上1、1，2、2。其中在1号两管事先加入DMEM液各2毫升。

6、10分钟后，把三角烧瓶取下，磁力搅拌器关上，用一个吸管轻轻吹打（使消化下来的细胞彻底从组织团快上掉下来），这个吸管（1）用后固定放在一个离心管中，以后每次消化后取下都用其吹打几下，第一次上清弃去，然后向两个1号管分别倒入2 mL上清（尽量不要把组织倒出，也不要剩液太多，以免消化下的细胞重复消化造成损伤），用另一个吸管（2）混匀配平两个管（即两个管水平高度相同），轻轻吹打，以免损坏细胞。

7、接着把这两个离心管放入离心机中，调10分钟，800或1000转，打开关。

8、同时向三角烧瓶中加入5 mL胰酶，继续消化8分钟，注意控制温度。此时向两个2号管中分别加入2 mL DMEM液。

9、取下三角烧瓶，仍用1号吸管吹打，后静置片刻向两个2号管分别倒入2 mL的上清，取出两个离心后的1号管，把上清液沿细胞贴壁一方慢慢倒掉，后向其中一管加入4 mL的DMEM液，用2号吸管取少量液体加入另一个离心管中，把管底的沉淀细胞洗下来，把液体全部移入其中一管，三个管（1个1号管，两个2号管）配平，放入离心管中，离心十分钟。同时仍加5 mL的胰酶，放入三角烧瓶中，继续消化（注意控制温度，达34℃时计时）。

10、消化到4次左右，吹打均匀后，吸一滴滴在载玻片上，拿到镜下观察消化情况，决定消化次数。

11、离心2次的吸管，放在试管架上，待离心过程全部完事后，把各管上清液倒掉，在各管加上3 mL（不用精确，大致这样）DMEM液，记住共加入多少DMEM液的量，换吸管（3号）把各管底细胞块吸下吹打均匀后，移入50ml烧杯中，然后用注射器抽取余量的DMEM加入烧杯中，加入小牛血清及抗生素，换吸管（4 号）吹打均匀。

12、取出24孔培养板接种，一个人吹打，另一个人用加样器加药。封盖时过火，盖上盖，放在CO2孵箱。24小时后观察是否贴壁。（24孔板，每孔最多加2 mL，一般加液时每孔加1~1.5 mL。

（四）试剂和器材

1、试剂：Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、小牛血清、碳酸氢钠液、盐酸液。

2、器材：

CO2 培养箱，超净工作台，XSZ-D 型倒置生物显微镜，高速冷冻离心机；

小剪子、小镊子（4套）（一套剪皮肤、一套开胸取心，一套剔除心缘纤维组织，一套剪碎心脏）、瓶皿（2套）[两个小圆培养皿，培养皿内加DMEM液，先后装取出的心和剔出纤维组织后的心] [一个小烧杯装碘酒和酒精棉球]、250 mL烧杯3个[一个用于水浴，事先加好水，是一或二蒸] [一个装0.1％新洁尔灭150 mL左右，消毒小鼠]、500 mL烧杯1个，用作废液缸、50 mL烧杯3个（剪碎心肌组织，最后配液）、三角烧杯（50 mL）+小转子（小转子，酒精擦，双蒸水冲后，再把酒精彻底冲掉后用三角烧杯高压）、离心管及帽（12-14个）、两个试管、吸管 （5~8个）、大镊子 （两把，持物，例夹棉球等）、24孔板、离心机；

超净台面放置的有：磁力搅拌器、纱布（事先用于托盘装0.1％新洁尔灭浸泡）、试管架、泡沫塑料板、五个针头（不用消毒）、75％酒精棉球及碘酒（消毒棉球，泡酒精、碘酒）、大镊子两把（一把夹棉球，一把取鼠）、3个250 mL烧瓶（一个装一蒸水，一个装新洁尔灭，另一为空的备用）、1个500 mL烧瓶（废液缸）、温度计、pH试纸（事先调pH值）、酒精灯、打火机/火柴、载玻片（5-10个）[用于培养前看接种密度及消化后看细胞密度]、注射器5ml 6个（胰酶、DMEM、小牛血清）、1 mL 2个（双抗液）、20 mL备用2个、微量加样器1000 mL及500 mL，以上物品均用紫外线照30分钟。

四、无菌操作的注意事项：
细胞原代培养一定要保持工作区的无菌清洁，先用紫外灯杀菌1h，操作前用75%乙醇消毒，穿上实验服，戴上口罩和帽子，操作时不能大声说话，双手戴上一次性橡胶手套，整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。

实验服务流程

威斯腾生物服务项目

分子生物学类	蛋白质与免疫学	动物实验
实时荧光定量PCR	单克隆抗体制备	帕金森疾病模型
免疫共沉淀（Co-IP）	多克隆抗体制备	抑郁症动物模型
ELISA（酶联免疫吸附法）技术	Western-blot 实验服务	脊髓损伤模型
生化指标检测	蛋白双向电泳实验服务	脑外损伤模型
双荧光素酶报告基因检测	原核蛋白表达纯化	骨神经损伤模型
染色质免疫共沉淀（ChIP）	真核蛋白表达纯化	心肌缺血模型
GST pull Down	ITRAQ定量蛋白质组学	心力衰竭模型
	SLAC蛋白组学	肺动脉高血压动物模型
		高血压模型
病毒类	实验课题整体外包	粥样动脉硬化模型
过表达/干扰慢病毒包装纯化	整体课题外包	大脑中动脉阻塞模型
过表达/干扰腺病毒包装纯化	细胞整体实验外包	慢性之气管炎模型
逆转录病毒包装纯化	动物整体实验外包	过敏性哮喘模型
腺相关病毒包装纯化		肺炎大鼠模型
		肝炎-肝硬化-肝癌模型
蛋白芯片	原代细胞培养	肝纤维化模型
细胞因子芯片	骨髓间充质干细胞培养	胆结石模型
生长因子芯片	脂肪干细胞培养	急性胰腺炎模型
信号通路磷酸化水平检测芯片	心肌成纤维细胞培养	急性肾衰竭模型
BioPlex悬浮芯片	软骨细胞培养	体内血栓模型
生长因子芯片	血管内皮细胞培养	关节炎模型
炎症因子芯片	神经元细胞培养	I型和II型糖尿病模型
血管生成因子芯片	内皮组细胞原代培养	裸鼠成瘤
凋亡因子芯片		基因编辑动物
趋化因子芯片	电生理相关服务	动物整体实验服务
HuProt TM 20K人类蛋白组芯片	膜片钳实验
细胞生物学	高通量测序	代谢组学
细胞原代培养	mRNA测序	气相色谱GC/MS
MTT检测	LncRNA测序	液相色谱LC/MS
细胞凋亡检测	全基因组测序	核磁共震NMR
细胞周期检测	RNA-Seq测序
细胞克隆形成实验	外显子测序	影像学相关实验
Transwell细胞迁移/侵袭	16s扩增子测序	Micro-CT
流式分选	Small RNA测序	小动物活体成像
CCK8/XTT检测	宏基因组测序	核磁共振
台盼蓝检测细胞活性	单细胞测序	PET-CT
药物筛选细胞学实验	circleRNA测序
细胞粘附性检测	甲基化测序	基因编辑动物
细胞划痕实验		条件性敲除小鼠/大鼠
细胞生物学整体实验		全基因敲除小鼠/大鼠
细胞成管实验
病理类	CRISPR/Cas9细胞敲除/敲入	基因芯片
扫描电镜	基因定点突变细胞系	LncRNA芯片
透射电镜	单基因敲除细胞系	miRNA芯片
HE染色	多基因敲除细胞系	mRNA芯片
免疫组化	目的基因敲入细胞系	甲基化芯片（限人和小鼠来源样本）
Tunel（原位末端凋亡法）检测	报告基因敲入细胞系	SNP芯片（限人和小鼠来源样本）
激光共聚焦	miRNA/LncRNA敲除细胞系
免疫荧光
Masson染色	CRISPR/Cas9动物敲除/敲入	科研方案设计与SCI相关服务
原位杂交	基因敲除大鼠/小鼠	科研文献论著翻译
荧光原位杂交	基因敲入大鼠/小鼠	SCI论文翻译润色服务
特殊染色（PSA、茜素红、阿尔新蓝等）		临床实验/科研实验设计方案指导
行为学检测	药物筛选服务项目	药效学评价
水迷宫实验	高通量自动药物筛选平台	神经系统药物药效学评价
旷场实验	细胞高内涵药物筛选平台	抗肿瘤药物药效学评价
重复性刻板行为检测	蛋白质组学靶标研发平台	心血管系统药物药效学评价
动物跑台检测	分子药理研究平台	泌尿系统药物药效学评价
强迫游泳	生物膜片钳药物筛选平台	内分泌系统药物药效学评价
	常规药物体外筛选	抗炎免疫药物药效学评价

【本平台合作项目】
分子生物学、细胞生物学、基因敲出/入、模式动物、SPF动物保种、病理学检测、免疫学检测、影像学检测、原代培养、细胞药筛、CRISPR/Cas9基因编辑、基因芯片、高通量测序、蛋白组学、代谢组学、高通量高内涵筛选、药效学评价、药理毒理学实验、慢病毒包装与稳转株建立、SiRNA与纳米载药、ChIP、CO-IP、生物信息学分析、知识产权服务！