Mouse Total IgE (IgEa and IgEb) Detection Kit小鼠抗总IgE(IgEa和IgEb)试剂盒

背景简介：

Ⅰ型超敏反应是一种典型的过敏性疾病，如哮喘、湿疹、花粉热、荨麻疹等。这种超敏反应是由IgE抗体介导的。IgE抗体与肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的高亲和力IgE受体（FcεRI）结合，并通过FcεRI（1）的稳定和积累显著上调FcεRI的表达，增强对过敏原的超敏反应。与细胞表面IgE抗体结合的特异性变应原交联FcεRI（2-3），引起肥大细胞的刺激和脱颗粒。这与多种促炎介质和细胞因子的释放有关，如组胺、蛋白水解酶、肝素和趋化因子，这些都会导致与I型超敏反应相关的症状。在过敏性疾病和寄生虫感染的疾病中，血清IgE抗体水平通常会升高。尽快血清IgE水平不能单独反应患者的过敏状态和临床症状，但是很明显血清IgE水平升高有助于诊断人类的这些疾病。
试剂盒组分：

组分	数量	规格	保存温度
IgE标准品（30051）	1	100ng/瓶，冻干粉	-20℃
捕获抗体（30052）	1	0.1ml	-20℃
检测抗体（30053）	1	冻干粉	-20℃
溶液A-包被缓冲液（30054）	1	10ml	-20℃
溶液B-样本、标准品缓冲液（30055）	1	50ml	-20℃
溶液C-检测抗体缓冲液（30056）	1	10ml	-20℃
溶液D-链亲和素-HRP缓冲液（9055）	1	20ml	-20℃
链亲和素-HRP(9029)	2	50ul/管	-20℃
TMB 显色液（90023）	2	0.2ml	-20℃
显色液稀释液（90022）	1	10ml	-20℃
洗液，20X(9005)	1	50ml	-20℃
ELISA 板	1	96孔（8x12）	-20℃

检测流程： 2）4℃孵育过夜，洗板。
3）加入100ul稀释后的标准品和样本。
4）室温孵育2小时，洗板。
5）加入100ul稀释后的检测抗体。
6）室温孵育1小时，洗板。
7）加入100ul吸收后的链亲和素-HRP。
8）室温孵育1小时，洗板。
9）加入100ul TMB显色液
10）室温孵育25min
11)加入50ul终止液
12）读取450nm/630nm吸光度值
注意事项：

1. 建议样本、标准品均做复孔检测
2. 用前所有的缓冲液置于室温平衡
3. 20X洗涤液低温可能会有结晶析出。如果有结晶析出，把洗涤液瓶置于温水中直至结晶完全溶解。
4. 用移液器准确定量提供的缓冲液，提供额外的缓冲液。
5. 每个步骤结束后，用封板膜封板，防止蒸发。
6. 如果只是用部分试剂，请参照操作步骤中的用量，做相应的使用量缓冲液配制。未使用的储液在原包装管内保存，置于-20℃保存。
7. 正常小鼠总IgE水平大概在50-100ng/ml,氢氧化铝佐剂免疫2周后，抗体水平提高到ug/ml。随后用抗原免疫后增加至10-20ug/ml。

操作流程：
1）加入包被抗体：用10ml包被抗体稀释液（Solution A）稀释1管包被抗体。或者根据用量按下表稀释。加入100ul稀释后的包被抗体液到各孔，4℃过夜孵育。剩余包被抗体储液-20℃冻存用于后续实验。

板条数	包被抗体	溶液A(ml)
2	17	1.7
4	33	3.3
6	50	5.0
8	66	6.6
10	82	8.2
12	100	10.0

 







 










10.洗涤：用1X稀释洗板至少三次。倒置微孔板，倒掉孔内液体，在吸水纸上拍干。不要让板干燥。
11.加入TMB:用新管制备TMB。用前10ml底物稀释液一管TMB。加入100ulTMB稀释液到各孔，室温孵育25min。

板条数	TMB（ul）	底物稀释液(ml)
2	34	1.7
4	66	3.3
6	100	5.0
8	132	6.6
10	164	8.2
12	200	10.0

12.终止：加入50ul 2N硫酸（终止液）到各孔。
13.读板：读取450nm OD值。如果样本OD值大于标准品最高OD值，样本稀释后重新检测。630nm波长，检测的副波长。
结果计算：