双萤光素酶检测（靶基因验证）

双萤光素酶检测服务
 

 

1、双萤光素酶报告系统介绍：
    双萤光素酶报告基因检测系统：在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase简称F-Luc)和海肾萤光素酶(Renilla luciferase简称R-Luc)，F-Luc作为报告基因反应目的基因表达的改变，R-Luc作为内参基因，为试验提供一基准线（减少内在变化因素如培养细胞的数目，细胞转染和裂解的效率对实验准确性的影响）。所构成的报告系统广泛用于基因调控、非编码RNA靶向互作等研究领域。

2、 应用介绍
2.1 靶基因验证
实验原理
    miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用（降解或抑制翻译），将目的基因3’UTR（野生型和结合位点突变型）序列构建至载体中报告基因F-Luc的3’端，通过比较过表达miRNA后，报告基因表达的改变（萤光素酶的活性下降还是不变），来确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。

案列介绍
题目: Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer
期刊: Nature communications
小结：验证B4GALT3（β-1,4-半乳糖基转移酶III）基因具有miR-1247-3p的靶向结合位点。将B4GALT3预测结合位点的序列克隆到报告基因载体，同时构建靶位点突变的载体，分别共转miR-1247-3p mimics及NC mimics，结果显示转染miR-1247-3p 的WT组相对荧光值降低，MUT组不变，提示存在靶向结合。

相关实验：miRNA同lncRNA/circRNA靶向互作
2.2 转录因子结合位点及启动子活性验证
实验原理
    转录因子主要通过作用于靶基因的启动子起作用，将目的基因启动子区序列替换报告基因F-Luc的启动子，通过共表达转录因子后，报告基因表达的改变，来确定转录因子与靶基因启动子结合位点及对靶基因的作用。

案列介绍
题目：Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop
期刊：Nature neuroscience
小结：验证Sox9在Sox2启动子区有多个结合位点，构建不同的启动子片段到报告基因载体中，共表达Sox9，显示插入片段的缩短和推测结合位点的减少，荧光素酶活性也随之下调。

3、常见应用方向总结
（1）验证miRNA同mRNA靶向互作。将靶mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该miRNA，如果萤光素酶活性下降，则提示为其靶序列。 
（2）验证miRNA同circRNA靶向互作。将circRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域，检测萤光素酶活性。 
（3）验证miRNA同lncRNA靶向互作。将lncRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域，检测萤光素酶活性。
（4）启动子活性分析。将启动子区域序列进行分段截短，再分别构建入报告基因载体，检测其启动子活性。
（5） 验证特定转录因子同启动子的作用。将启动子区域插入报告基因载体，同时在实验细胞中共转该转录因子，分析转录因子过表达是否提高萤光素酶活性。 
（6）分析信号通路是否激活。将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体，在不同上游信号条件下，萤光素酶活性代表了通路的下游响应。

4、技术路线：
根据实验目的设计实验方案—预测结合位点--构建野生/突变报告基因载体系统---共转染细胞---检测酶活

客户提供：
1.启动子转录活性调控：提供转录因子名称及ID、靶基因名称及ID。
2. miRNA靶基因验证：提供miRNA名称、物种信息、靶基因名称及ID。
3.实验细胞，如无特殊要求，和元默认使用293T细胞。