AAV在神经科学中的应用

一、神经研究病毒载体的选择

	慢病毒	腺病毒	腺相关病毒
优势	整合到基因组，可构建稳定过表达或干扰。一般只适合细胞系及原代神经元细胞	适合原代细胞，如原代神经元等；包装容量大，高达6kb；体内、体外快速表达（24-36 小时）；	适合在体基因转导；安全性高（免疫原性低）、均一性好（分子小，可均匀扩散）、长效性（稳定表达3-6个月），特异性强（有不同的组织亲和性）
局限	滴度低，在体感染心脏效率低；随机插入基因组，有致瘤风险；	免疫原性高，可能引发强烈的免疫反应，导致动物死亡或者腺病毒被免疫；表达周期短，大约2周时间；只能开胸进行心肌原位注射，静脉注射效果差；	表达到高峰所需的时间长，通常需要三周。

二、腺相关病毒的选择
1、  不同的血清型和特异性启动子：
AAV有不用的血清型，可以特异性亲和不同的组织，对于脑部，一般选择AAV2/AAV9。但是，脑部有不同种类的神经细胞，无论是AAV2还是AAV9，都不能只在某种神经细胞中绝对特异性表达，于是针对不同的神经细胞，我们研发出了不同的启动子类型，以期能在特定细胞中表达：

Syn	感染全脑神经元细胞
CaMKII	感染全脑兴奋性神经元细胞
GFAP	感染全脑星形胶质细胞

图1所示的是用GFAP特异性启动子特异性感染星型胶质细胞示意图（图1）。


图1：:星型胶质细胞特异性启动子的AAV注射小鼠海马组织效果图
病毒：HBAAV-GFAP-GFP，10^12vg/ml
实验动物：C57小鼠，8周龄
注射方法与体积：脑定位注射，海马区，1ul
检测方法：注射3周后冰冻切片，荧光显微镜检测
2、  DIO元件：
对于特异性更高的实验，比如只需要在脑区表达某个基因，可以用含有DIO元件的病毒。DIO原件的病毒只有在cre动物模型中才会表达。因此，只需用cre敲入动物某个脑区，再将含有DIO元件的病毒打入特定脑区，便能实现绝对的特异性表达。
3、穿透血脑屏障的AAV/BBB：
因为血脑屏障的存在，通过尾静脉或者其他脑部以下部位给药，很难到达脑部，但是脑部注射操作麻烦而且对动物伤害比较大，汉恒生物研发出了一种可以穿透血脑屏障的AAV，可以直接通过尾静脉注射感染全脑。


图2：HBAAV/BBB注射小鼠尾静脉可透过血脑屏障感染脑组织
病毒：汉恒生物穿血脑屏障AAV2/BBB-CAG-Zsgreen
滴度：1.4x10^12vg/ml
注射量：100 微升
注射部位：尾静脉
检测方法：注射感染3周，取材切片，confocol检测拍照
4、神经逆行标记AAV-Retro：
人体的感知、运动等功能都和神经元的长距离信号传导密切相关。在科学研究中，如何高效标记和操作投射神经元一直是广大科研工作者所面对的难题。标记物在神经元中沿其轴突从胞体行末梢进行示踪为顺行标记，从末梢行胞体进行示踪的为逆行标记，而拥有逆行标记能力的研究工具比较缺乏。
汉恒生物采用自包装神经逆行标记病毒AAV2/retro-EGFP病毒注射小鼠SNc（黑质致密部）部位，3周后取材切脑片检测其他脑区的荧光表达情况。发现在MGP（内侧苍白球）、LGP（外侧苍白球）、PFC（前额叶皮层）等部位可以检测到明显荧光表达，证明SNc神经元对MGP、LGP、PFC等区域均有大量投射。


图3：AAV2/retro-EGFP病毒注射小鼠SNc部位可逆行标记至MGP、LGP、PFC部位
病毒：AAV2/retro-EGFP
滴度：1.3x10^12vg/ml
注射量：1 微升
注射部位：SNc（黑质致密部）
检测方法：注射感染3周，取材切片，confocol检测拍照
5、光遗传学和化学遗传学AAV：
光遗传学（optogenetics）是结合了光学（optics）及遗传学（genetics）的技术，能在活体动物甚至是自由运动的动物脑内，精准地控制特定种类神经元的活动。光遗传学在时间上的精确度可达到毫秒级别，在空间上的精确度则能达到单个细胞级别。这项技术目前在神经科学领域应用非常广泛，未来可能会应用于多种神经和精神疾病的治疗，如帕金森氏病、阿尔茨海默病、脊髓损伤、精神分裂症等。
化学遗传学是指：对一些生物大分子实行改造，使其能和先前无法识别的小分子进行相互作用的过程。化学遗传学和分子遗传学一样，均是遗传学的一个分支，由于其可控的、可逆的（可以随时加入或除去化合物，从而启动或中断特定的反应）特性，已经在信号转导、药物开发、功能基因组学等方面的研究中得到了广泛的应用。如下左图为光遗传学原理，右图是化学遗传学原理：



图4：上图为光遗传示意图；下图为化学遗传示意图

三、AAV血清型选择及注射方式

感染部位	推荐的血清型	注射方式	动物	注射体积（ ul）
全脑	AAV-BBB	尾静脉注射	大鼠	250-300
			小鼠	100
侧脑室	9型	立体定位注射	大鼠	1-5
			小鼠	1-5
脑组织	9型	立体定位注射	大鼠	2-3
			小鼠	1-2
脊髓	9型	鞘内注射	大鼠	查阅文献确认
			小鼠

脑定位/鞘内注射/尾静脉注射视频，请关注汉恒生物公众号：


四、客户发表文章节选

名称	杂志名称	IF	单位	使用方法
Laterodorsal tegmentum interneuron subtypes oppositely regulate  olfactory cue-induced innate fear	NATURE  NEUROSCIENCE	17.839	浙江大学	AAV光遗传-小鼠大脑外侧僵核（LHB）
Local GABAergic signaling within sensory ganglia controls  peripheral nociceptive transmission	The  Journal of Clinical Investigation	12.784	河北医科大学	AAV9感染DRG，脊椎注射
Pre-ischemia melatonin treatment alleviated acute neuronal  injury after ischemic stroke by inhibiting ER stress-dependent autophagy via  PERK and IRE1 signalings	JOURNAL  OF PINEAL RESEARCH	10.391	第四军医大学唐都医院	AAV-LC3双标，感染小鼠大脑皮质（ipsilateral  cortex）监测自噬流
Endoplasmic reticulum stress induced by tunicamycin and thapsigargin protects against transient ischemic brain injury: Involvement of PARK2-dependent mitophagy	Autophagy	8.593	浙江大学	AAV9-LC3 感染小鼠原代神经元
BNIP3L/NIX-mediated mitophagy protects against ischemic brain injury independent of PARK2	Autophagy	8.593	浙江大学	AAV9单标LC3感染原代神经元
Cholinergic Grb2-Associated-Binding Protein 1 Regulates  Cognitive Function	Cerebral  Cortex	6.559	浙江大学	AAV9-DIO注射CRE小鼠胆碱能神经元
Adeno-associated virus 9–mediated Cdk5 inhibitory peptide  reverses pathologic changes and behavioral deficits in the Alzheimer’s  disease mouse model	FASEB  JOURNAL	5.498	南方医科大学南方医院	AAV9立体定位小鼠侧脑室注射
Neuroinflammation contributes to autophagy flux blockage in the  neurons of rostral ventrolateral medulla in stress-induced hypertension rats	Journal  of Neuroinflammation	5.102	复旦大学医学院	AAV9，感染大鼠延髓头端腹外侧区神经元
MiR-134 modulates chronic stress-induced structural plasticity  and depression-like behaviors via downregulation of Limk1/cofilin signaling  in rats	Neuropharmacology	5.012	山东大学	AAV8-大鼠大脑
Kainate receptor mediated presynaptic LTP in agranular insular  cortex contributes to fear and anxiety in mice	Neuropharmacology	5.012	北京药理毒理研究所	AAV9-小鼠大脑
CRISPR/Cas9-mediated targeting of the Rosa26 locus produces Cre  reporter rat strains for monitoring Cre–loxP-mediated lineage tracing	FEBS  Journal	3.902	中国医学科学院北京协和医院	AV9-CAG-Cre感染大鼠海马和肌肉
Central administration of tert-butylhydroquinone attenuates  hypertension via regulating Nrf2 signaling in the hypothalamic  paraventricular nucleus of hypertensive rats	Toxicology  and Applied Pharmacology	3.791	西安交通大学	AAV9感染大鼠下丘脑室旁核（PVN）
Astrocyte Autophagy Flux Protects Neurons Against Oxygen-Glucose  Deprivation and Ischemic/Reperfusion Injury	Rejuvenation  Research	2.827	第四军医大学西京医院	AAV9-GFAP启动子注射小鼠半影区神经元