StarPure Endo-free Plasmid Maxiprep Spin Kit价格_品牌:康朗生物-丁香通官网

保存条件：本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。内毒素清除剂常温运输，4度可以保存一个月，长期保存放-20℃。

保质期：本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。内毒素清除剂常温运输，4度可以保存一个月，长期保存放-20℃。

英文名：StarPure Endo-free Plasmid Maxiprep Spin Kit

库存：大量

供应商：上海康朗生物科技有限公司

规格：ml/盒

StarPure Endo-free Plasmid Maxiprep Spin Kit

内毒素（endotoxin or lipopolysaccharides, LPS）是构成革兰氏阴性菌细胞壁的主要组成成分，对原代细胞和实验动物有强烈的毒性，是造成转染实验失败的主要原因之一。由于内毒素聚合物的分子量大小和带电性与质粒DNA和部分蛋白质十分相近，很难用离子交换柱、硅胶膜吸附柱、凝胶过滤、氯化铯超速离心等常规纯化方法有效去除，因而提取的质粒DNA或蛋白质样品中往往有大量内毒素污染，最高可达1,000~1,500 EU/μg质粒。
StarPure无内毒素质粒大提试剂盒可最大限度地去除质粒DNA样品中的内毒素，以保证对不同的细胞系都能获得稳定的转染效果。本产品采用改良的碱裂解－中和法，结合硅胶膜吸附技术和内毒素清除剂，使质粒DNA获得高效、专一的吸附，再通过去蛋白液和漂洗液去除基因组DNA、蛋白等其他杂质，最后通过低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净的质粒DNA从硅基质膜上洗脱下来。该方法提取的质粒DNA无基因组DNA、RNA、蛋白质污染，内毒素清除率在90%以上；通常每50~100 ml过夜培养的菌液中可提取出300~500 μg左右的高纯度高拷贝质粒DNA，可直接用于转染真核细胞、荧光测序、酶切、PCR、转化、体外转录等各种常规分子生物学实验。本试剂盒适宜提取各种大小的质粒，对20 kb以下的质粒效果更佳。
用途
• 真核细胞转染
• 实验动物注射
• 常规分子生物学应用，如酶切、PCR、测序、转化、体外转录等
特点
• 高纯度：OD_260/280=1.8~2.0，无基因组DNA、RNA和蛋白质污染，内毒素清除率达90%以上
• 快速简便：比传统方法大大节省时间
• 操作安全：无需苯酚/氯仿抽提或乙醇沉淀
• 批次稳定：采用质量可靠的进口硅胶吸附膜，遵循标准化生产流程，通过严格质检标准
产品组分及保存条件

成分	10次（D209-01）	保存
RNaseA（10mg/ml）	750µl	-20℃
溶液S1	77 ml	4℃
溶液S2	77 ml	室温
溶液S3	77 ml	室温
内毒素清除剂	25 ml	-20℃
漂洗液WB	25 ml X 2 第一次使用前按说明加指定量乙醇	室温
洗脱缓冲液EB	20 ml	室温
离心吸附柱及收集管	10套	室温

【质量控制】
• 从200 ml过夜培养的大肠杆菌DH5α菌液中可提取约1 mg pEGFP-N1质粒
• 提取的质粒OD_260/280值在1.9左右，转染HEK-293细胞，效率在90%以上
【保存条件】
本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。内毒素清除剂常温运输，4度可以保存一个月，长期保存放-20℃。
【注意事项】
1. 所有的离心步骤如未加另外说明均在室温完成，使用转速可以达到12,000 x g，带50ml转头的台式离心机。
2. 提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10 kb 的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加S1、S2、S3 的用量，洗脱缓冲液应在70℃预热。可以适当的延长吸附和洗脱的时间，以增加提取效率。
3. 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。
4. 质粒DNA确切分子大小，必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。
5. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱，质粒应该保存在-20℃。质粒DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。
6. 第一次使用前请先在2瓶漂洗液WB中分别加入100ml无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入。
7. 将RNase A 全部加入溶液P1中，混匀，每次使用后置于2~8℃保存。
【操作步骤】
1. 取150-200 ml (最多不超过300 ml)过夜培养的菌液，12,000xg（约10,000rpm），离心1-2分钟，尽可能的倒干上清，收集菌体。
2. 收集超过50毫升菌液，可以离心弃上清后，在同一个50ml管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。
3. 用7.5 ml溶液S1重悬菌体沉淀，移液器吹打或者涡旋振荡至彻底悬浮。
如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
4. 加7.5 ml的溶液S2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解，室温放置4-5分钟。
温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠。如果很浑浊，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
5. 加7.5 ml溶液S3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀此时会出现白色絮状沉淀。12,000 x g离心10-15分钟，小心取上清至新管，避免吸取到漂浮白色沉淀。
加入溶液S3后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。
6. 加入0.1体积(上清的体积的10%，约2.4ml)的内毒素清除剂到上一步所得上清，颠倒旋转混匀，冰浴或者插入碎冰中(或冰箱冷冻室)放置5分钟直到浑浊变清亮透明（或仍旧稍有浑浊），中间偶尔混匀几次。
内毒素清除剂加入上清后，上清会变得浑浊，但是冰浴后应恢复清亮（或稍浑浊）。
7. 常温放置3-5分钟，温度恢复室温溶液很快变为浑浊，颠倒混匀。
如室内温度较低或者想加快速度可以在37-42℃水浴，将很快变浑浊，颠倒混匀。
8. 室温8,000-10,000 x g离心10 分钟分相。上层水相含DNA，下层蓝色油状相含内毒素和其它杂质。将含DNA的上层水相转移到新管（注意不要吸到蓝色油状层，里面含内毒素等杂质），弃油状层。
9. 向上层水相中加入0.5体积异丙醇（约11ml）后充分颠倒混匀后分多次（每次不超过15ml）转入吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12,000 x g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。直到所有混合溶液通过此吸附柱。
10. 加入10ml漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 x g离心1分钟，弃掉废液。再加入10ml漂洗液WB，重复漂洗一次。
11. 将吸附柱放回空收集管中，最高速（最好大于12,000 x g）离心3分钟以干燥基质膜上残留乙醇，用枪头吸除内圈压环和柱壁之间可能残留的乙醇，打开盖子室温晾干3-5分钟。
该步骤为彻底去除吸附柱中残留乙醇，残留乙醇抑制下游反应并且严重降低洗脱效率，降低质粒产量。
12. 取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加1-2ml洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热可提高产量），室温放置3分钟，12,000 x g离心3分钟。
推荐：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置3分钟，12,000 x g离心3分钟。洗脱两遍可提高浓度约10%。洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是需注意体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量（最小不应少于1ml）。