间充质干细胞（MSC）三系诱导分化（成骨、成脂、成软骨分化）试剂盒

保存条件 ：详见说明书

保质期 ：12月

英文名 ：MSC

库存 ：1组

供应商 ：上海麒盟生物科技有限公司

CAS号 ：联系商家

规格 ：详见说明书

间充质干细胞（MSC）三系诱导分化试剂盒产品介绍：
间充质干细胞（MSC）具有多向分化的潜能，体外在一定条件下可以诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞。2006年国际细胞治疗协会（ISCT）确定此三项检测指标是MSC鉴定的必检项目，目前以MSC为基础的研究报道均会对该三个指标进行鉴定。

为方便科研用户鉴定MSC的分化能力，麒盟干细胞研究中心精心优化MSC成脂诱导分化试剂盒，其中包括成脂诱导培养体系和鉴定所需要的染色液，让用户可以稳定有效地鉴定MSC的分化潜能。该试剂盒提供的实验方法为常规鉴定方法，用于鉴定MSC是否具有成骨分化能力。除此以外，试剂盒的诱导培养基还可用于诱导分化过程中的其他检测，如mRNA检测、lncRNA检测、microRNA检测、蛋白表达检测、免疫组化检测等。但若用于免疫荧光检测需注意脂肪颗粒导致的自发荧光或遮光问题。 间充质干细胞成脂分化试剂盒产品信息
产品名称：间充质干细胞成脂分化试剂盒
货号：CHEM-2000**
试剂清单：

序号	名称	数量	货号
A	***间充质干细胞成脂分化基础培养基A	1	CHEM-200002-A
B	***间充质干细胞成脂分化血清	2	CHEM-200002-B
C	双抗	2	CHEM-200002-C
D	胰岛素	2	CHEM-200002-D
E	3-异丁基-1-甲基黄嘌呤	1	CHEM-200002-E
F	罗格列酮	1	CHEM-200002-F
G	地塞米松	1	CHEM-200002-G
H	***间充质干细胞成脂分化基础培养基B	1	CHEM-200002-H
I	油红O染色液（储液）	1	CHEM-200002-I
J	明胶溶液	1	CHEM-100001-J

间充质干细胞成脂分化试剂盒存储与有效期：
A、D、H、I、J液于2-8 ℃避光保存，其余溶液于-20 ℃避光保存。所有组分均需要避免反复冻融及复温，各组分在所需要的温度下有效期为1年，配制完成的完全培养基于2-8 ℃保存，有效期为1个月。

间充质干细胞成脂分化试剂盒操作方法
实验准备
1、试剂配制：2-8 ℃冰箱中过夜溶解B液一支。
诱导液A：室温融化C、E、F、G溶液各一支，将融化的溶液加入A液中，然后将B、D液加入A液中，晃动培养基使其充分混匀，配制成诱导液A。
诱导液B：将B、D液加入H液中，晃动培养基使其充分混匀，配置成诱导液B。
油红O染液（工作液）：取油红O储液，与蒸馏水以3：2的比例混合均匀，中性滤纸过滤，即配制成了油红O染液（工作液）。

2、培养皿处理：
加适量明胶溶液到培养器皿中，轻轻摇动使其覆盖整个培养器皿底面，室温静置30-60分钟。弃去明胶溶液 ，室温晾干。
 
3、自备试剂：
l  消化液（0.25%Trypsin-0.04%EDTA ）
l  磷酸盐缓冲液（DPBS）
l  **MSC完全培养基
l  4%中性固定溶液

操作步骤
1.      准备所需诱导分化的**MSC，当细胞融合达85%左右时，用消化液消化细胞，并用**MSC完全培养基重悬。
2.      按照3×10⁴ cells/cm²的密度将细胞接种于已明胶处理的六孔板中，每孔**MSC完全培养基2 ml，37℃、5%CO₂培养箱中培养。
3.      当细胞融合达85%时，弃去原培养上清，添加诱导液A 2 ml/well，37℃、5%CO₂培养箱中培养。
4.      诱导培养72 h后弃去原培养上清，添加诱导液B 2 ml/well，37℃、5%CO₂培养箱中培养。
5.      诱导培养24 h后弃去原培养上清，添加诱导液A 2 ml/well，37℃、5%CO₂培养箱中培养。
6.      重复步骤4、5约3-5次，待细胞内出现明显脂滴时更换为诱导液B继续培养。
7.      每2天更换新鲜诱导液B，继续培养至脂滴足够大时培养结束。
8.      诱导培养结束时，弃去培养上清，DPBS洗细胞两次，4%中性固定溶液2 ml/well室温固定细胞20分钟。
9.      弃去固定液，DPBS洗2次，加入油红O染液1 ml/well染色15分钟。
10.  弃去油红O染液，DPBS洗3次。
11.  显微镜下观察并拍照。

结果判定：
按照程序操作完毕，低倍镜下观察可见大面积红色着色点，20倍和40倍镜下可观察到红色球形在细胞内的情况，此红色着色球为脂滴，说明实验所用的**MSC具有成脂能力。否则，所使用的**MSC无成脂能力。

结果展示
   

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名称	货号
**间充质干细胞成骨分化试剂盒	CHEM-2000**
**间充质干细胞成软骨分化试剂盒	CHEM-2000**

 
间充质干细胞成骨分化试剂盒产品信息
产品名称：间充质干细胞成骨分化试剂盒
货号：CHEM-2000**
试剂清单：

序号	名称	数量	货号
A	***间充质干细胞成骨分化培养基	2	CHEM-200001-A
B	***间充质干细胞成骨分化血清	1	CHEM-200001-B
C	双抗	2	CHEM-200001-C
D	抗坏血酸		CHEM-200001-D
E	β-甘油磷酸钠	2	CHEM-200001-E
F	地塞米松	2	CHEM-200001-F
G	茜素红染液	1	CHEM-200001-G
H	明胶溶液	2	CHEM-100001-H

间充质干细胞成骨分化试剂盒存储与有效期：
A、G、H液于2-8 ℃避光保存，B-F液于-20 ℃避光保存。所有组分均需要避免反复冻融及复温，各组分在所需要的温度下有效期为1年，配制完成的完全培养基于2-8 ℃保存，有效期为2个月。

操作方法
实验准备
1、  试剂配制：
室温融化C、D、E、F溶液，将融化的溶液加入A液中，然后将B液加入A液中，充分混匀。

2、培养皿处理：
加适量明胶溶液到培养器皿中，轻轻摇动使其覆盖整个培养器皿底面，室温静置30-60分钟。弃去明胶溶液 ，室温晾干。

3、 自备试剂：
l  消化液（0.25%Trypsin-0.04%EDTA ）
l  磷酸盐缓冲液（DPBS）
l  **MSC完全培养基
l  4%中性固定溶液

操作步骤
12.  准备所需诱导分化的**MSC，当细胞融合达85%左右时，用消化液消化细胞，并用**MSC完全培养基重悬。
13.  按照4×10⁴ cells/cm²的密度将细胞接种于已明胶处理的六孔板中，每孔**MSC完全培养基2 ml，37℃、5%CO₂培养箱中培养。
14.  当细胞融合达60%时，弃去培养上清，每孔添加**MSC成骨诱导分化完全培养基2 ml/well，37℃、5%CO₂培养箱中培养。
15.  每3天更换新鲜的**MSC成骨诱导分化完全培养基，持续培养2-4周。
16.  诱导培养结束时，弃去培养上清，DPBS洗细胞两次，4%中性固定溶液2 ml/well室温固定细胞20分钟。
17.  弃去固定液，DPBS洗2次，加入茜素红染液1 ml/well染色15分钟。
18.  弃去茜素红染液，DPBS洗3次。
19.  显微镜下观察并拍照。

结果判定：
按照程序操作完毕，低倍镜下观察可见红色着色点，此处为钙结节，说明实验所用的**MSC具有成骨能力。否则，所使用的**MSC无成骨能力。

结果展示
   
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名称	货号
***间充质干细胞成脂分化试剂盒	CHEM-2000**
***间充质干细胞成软骨分化试剂盒	CHEM-2000**

间充质干细胞成软骨分化试剂盒产品信息
产品名称：间充质干细胞成软骨分化试剂盒
货号：CHEM-2000**
试剂清单：

序号	名称	数量	货号
A	***间充质干细胞成软骨分化基础培养基	2	CHEM-200015-A
B	双抗	2	CHEM-200015-B
C	抗坏血酸	2	CHEM-200015-C
D	丙/酮酸钠	2	CHEM-200015-D
E	地塞米松	2	CHEM-200015-E
F	脯氨酸	2	CHEM-200015-F
G	ITS+Premix	2	CHEM-200015-G
H	TGF-β3	2	CHEM-200015-H
I	阿利新蓝染色液	1	CHEM-200015-I

间充质干细胞成软骨分化试剂盒存储与有效期：
A、E、J液于2-8 ℃避光保存，其余溶液于-20 ℃（或更低温度）避光保存。所有组分均需要避免反复冻融及复温，I液有效期为6个月，其他组分在所需要的温度下有效期为1年。预混液于2-8 ℃保存，有效期为1个月，完全培养基现配现用。

操作方法
实验准备
1、试剂配制：
预混液：室温融化B-G溶液各一支，将融化的溶液B-G加入A液中，晃动培养基使其充分混匀，配制成软骨分化培养基预混液。
TGF-β3分装：室温溶解I液，根据每次换液需要的试剂量分装成小份，-20℃或更低温度保存。
诱导完全培养基：按照当次所需要的诱导液总量取相应的预混液与离心管中，加入相应量的TGF-β3，充分混匀制成诱导完全培养基，此液现配现用。1 ml预混液需添加TGF-β3的量为10 μl。

2、自备试剂：
l  消化液（0.25%Trypsin-0.04%EDTA）
l  磷酸盐缓冲液（DPBS）
l  **MSC完全培养基
l  4%中性固定溶液

操作步骤
20.  准备所需诱导分化的**MSC，当细胞融合达85%左右时，用消化液消化细胞，细胞沉淀用成软骨诱导预混液重悬。
21.  150 g离心5 min，沉淀以预混液重悬，细胞密度约1×10⁶ cells/ml，再次离心，弃上清。
22.  沉淀以成软骨诱导完全培养基重新悬浮，调整细胞密度为5×10⁵ cells/ml。
23.  分别取500 μl细胞悬液接种于15 ml离心管中，150 g离心5 min。
24.  旋松离心管盖，将离心管轻轻置于37 ℃、5% CO₂培养箱中静置培养。
25.  诱导培养24 h后，轻轻拨动离心管底，使细胞沉淀团块悬浮，重新放回培养箱继续培养。
26.  每2天更换新鲜完全诱导培养基。换液时轻轻吸取旧培养基，每管加新鲜配制的成软骨分化完全培养基500 μl。
27.  诱导培养结束时，弃去培养上清，DPBS洗细胞两次，4%中性固定溶液2 ml/管室温固定细胞1小时。
28.  弃去固定液，DPBS洗2次，脱水、石蜡包埋后切片。
29.  阿利新蓝染色：将切片进行脱腊和复水，阿利新蓝染液染色30 min，流水冲洗5 min，脱水、透明、中性树胶封片，显微镜下观察、拍照。

结果判定：
按照程序操作完毕，低倍镜下观察可见蓝色着色，该蓝色染色的为酸性粘多糖，说明实验所用的**MSC具有成软骨能力。否则，所使用的**MSC无成软骨能力。

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名称	货号
***间充质干细胞成骨分化试剂盒	CHEM-2000**
***间充质干细胞成脂分化试剂盒	CHEM-2000**