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文献和实验
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保存条件 :2~8℃
保质期 :长期
英文名 :Tricine-SDS-PAGE Gel Kit
库存 :915
供应商 :北京百奥莱博科技有限公司
特别声明:本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品,严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。
北京百奥莱博专业生产销*(代"售")Tricine-SDS-PAGE凝胶制备试剂盒优惠价,我公司供应的分子生物学试剂品类齐全,且具有优势价格,欢迎新老客户垂询订购。
名称:Tricine-SDS-PAGE凝胶制备试剂盒优惠价
产地:国产|进口
规格:50次
品牌:百奥莱博
常规的Tris-SDS-PAGE电泳的只能分辨大分子蛋白,对于相对分子量小的,尤其是10 kD以下的蛋白分辨率极低。而Tricine-SDS-PAGE可以很好的分离分子量在1-10 kD的蛋白及多肽,成为目前电泳法变性分离多肽的主要方法。本产品包括Tricine-SDS-PAGE凝胶制备所需全*(代"套")试剂,只需自备蒸馏水,即可制备高质量各种浓度的凝胶,方便、快捷,电泳后可直接用于考染、银染、Western杂交等实验。
试剂盒组成:
组份 | 50次 |
49.5%T 3%C | 30ml |
49.5%T 6%C | 100ml |
Tricine-SDS-PAGE Gel Buffer | 140ml |
Glycerol | 30ml |
APS | 0.5 g |
TEMED | 750μl |
本产品所提供的APS(过硫*(代"酸")铵)为固体粉末,使用前加入纯水溶解即配制成10%APS溶液(0.5 g APS加5ml纯水),将溶液分装后置于-20℃保存,通常半年内有效。溶液在使用中可放置4℃保存两周。
注意事项:
1、本产品所提供的APS(过硫*(代"酸")铵)为固体粉末,使用前加入纯水溶解即配制成10%APS溶液(0.5 g APS加5ml纯水),10%APS配制后分装-20度保存。APS溶液不稳定,应尽量减少室温存放时间,每次取用后立即放回冰箱,以防失效;若发现凝胶聚合时间延长,应考虑更换,使用-20℃保存的10%APS。
2、在凝胶配制过程中,尤其是液体混匀步骤,应尽量避免气泡的产生。
3、在分离胶上层加纯水时要小心操作,加水时速度不能太快。
4、丙*(代"烯")酰胺具有神经毒性,操作时请穿着实验服并佩戴一次性手套。
5、本产品仅用于科研,不能用于人体实验或人体治疗。
操作步骤:
根据目的蛋白分子量大小选择合适的PAGE分离胶配制浓度,凝胶浓度配方参考附表。
I 配制分离胶
1、将不同体积的纯水、49.5%T 6%C、Tricine-SDS-PAGE Gel Buffer和Glycerol(甘油)加入到离心管中混合。
2、加入10%APS和TEMED,立即涡旋混匀5-10秒,以使溶液充分混匀。
3、在凝胶模具中迅速灌入适量分离胶溶液(对于1 mm mini-gel,分离胶溶液加约4ml),然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-3 cm的水层,使凝胶表面保持平整。
4、静置,待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。
II 配制夹层胶
去除覆盖在分离胶上的水层,用滤纸将残留的水尽量吸去。
1、将不同体积的纯水、49.5%T 3%C和Tricine-SDS-PAGE Gel Buffer加入到离心管中混合。
2、加入10%APS和TEMED,立即涡旋混匀5-10秒,以使溶液充分混匀。
3、将适量的夹层胶溶液迅速加至分离胶的上面(对于1 mm的mini-gel,夹层胶溶液加约1ml), 然后在夹层胶溶液上轻轻覆盖一层水层,使凝胶表面保持平整。
4、静置,待夹层胶和水层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。
附表Tricine-SDS-PAGE凝胶配方表:
组份 | 分离胶(胶浓度/配制体积) | 夹层胶 (胶浓度/配制体积) |
浓缩胶 (胶浓度/配制体积) |
||
20%/4.5ml | 16.5%/4.5ml | 15.5%/4.5ml | 10%/2ml | 4%/2ml | |
49.5%T 3%C | - | - | - | 0.407ml | 0.16ml |
49.5%T 6%C | 1.82ml | 1.5ml | 1.395ml | - | - |
凝胶缓冲液 | 1.5ml | 1.5ml | 1.5ml | 0.667ml | 0.496ml |
甘油 | 0.48ml | 0.48ml | 0.48ml | - | - |
ddH2O | 0.7ml | 1.02ml | 1.125ml | 0.926ml | 1.344ml |
10% AP | 40μl | 40μl | 40μl | 20μl | 20μl |
TEMED | 5μl | 5μl | 5μl | 3μl | 3μl |
III 配制浓缩胶
去除覆盖在夹层胶上的水层,用滤纸将残留的水吸去。
1、将不同体积的纯水、49.5%T 3%C和Tricine-SDS-PAGE Gel Buffer加入到离心管中混合。
2、加入10%APS和TEMED,立即涡旋混匀5-10秒,以使溶液充分混匀。
3、将梳子插入凝胶内,避免产生气泡。
4、待凝胶聚合后,小心地拔出梳子,以免破坏加样孔。
5、进行电泳操作。
IV 电泳
将电泳槽放入4℃或冰水浴中,外槽加入阳极缓冲液,内槽加入阴极缓冲液,30V预电泳10 min,将样品(已经过Tricine专用上样缓冲液处理)加入点样孔后30V电泳1小时,100V电泳至*酚蓝到达胶底部后停止电泳,进行后续的考马斯亮蓝染色或电转。
储存条件:2~8℃
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Tricine-SDS-PAGE凝胶制备试剂盒优惠价关键词:Tricine-SDS-PAGE Gel Kit,WE0279,Tricine-SDS-PAGE凝胶制备试剂盒
·通用型柱式DNA提取试剂盒
编号:WE0190
英文名称:Universal Genomic DNA Extraction Kit
规格:50次|200次
本试剂盒适合于从新鲜或冷冻的动物组织、细胞、血液、细菌等多种样品中提取高纯度总DNA。本品可纯化获得分子量最大为50 kb的DNA片段,纯化过程不需使用*酚或*仿等有毒溶剂,无需乙醇沉淀。本试剂盒采用优化的缓冲体系使裂解液中的DNA高效特异的结合到硅基质离心吸附柱上,PCR和其他酶促反应的抑制剂可通过两步洗涤步骤被有效去除,最后使用低盐缓冲液或水洗脱,即可得到高纯度DNA。纯化得到的DNA可以直接用于酶切、PCR、Real-Time PCR、文库构建、Southern Blot、分子标记等下游实验。
试剂盒组成:
组份 | 50次 | 200次 |
Buffer GTL | 15ml | 60ml |
Buffer GL | 15ml | 50ml |
Buffer GW1(浓缩液) | 13ml | 52ml |
Buffer GW2(浓缩液) | 15ml | 50ml |
Buffer GE | 15ml | 60ml |
蛋白酶K | 25 mg | 90 mg |
蛋白酶K 储存液 | 1.25ml | 5ml |
吸附柱DM及收集管 | 50套 | 200套 |
自备试剂:无水乙醇,Enzymatic Lysis Buffer(提取革兰氏阳性菌基因组DNA时须准备)。
Enzymatic Lysis Buffe配方:20 mM Tris,pH8.0;2 mM Na2-EDTA;1.2% Triton X-100;终浓度为20 mg/ml的Lysozyme(溶菌酶)。
实验前准备及重要注意事项/strong>:
1.向蛋白酶K 中加入指定用量(1.25ml|4.5ml)的蛋白酶K 储存液使其溶解,-20℃保存。配制好的蛋白酶K 勿长时间室温放置,避免反复冻融,以免影响其活性。
2、样品应避免反复冻融,否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。
3、如果提取次生代谢产物大量积累或细胞壁厚的细菌培养物的基因组,建议在对数生长期早期收集样品。
4、第一次使用前应按试剂瓶标签的说明在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇。
5、使用前请检查Buffer GTL和Buffer GL是否出现结晶或者沉淀,如有结晶或者沉淀,请将Buffer GL和Buffer GTL于56℃水浴重新溶解。
6、如果下游实验对RNA污染比较敏感,可以在加入Buffer GL前加入4μl DNase-Free的RNase A(100 mg/ml),RNase A 本试剂盒并未提供,如需要可单独向本公司订购,货号:WE0225S。
操作步骤:
一、血液及细胞样本基因组提取:
1、材料处理
a. 如果提取材料为哺乳动物抗凝血液(无核红细胞),可直接向50-200μl新鲜或冷冻的抗凝血液样品中加入Buffer GTL补足至200μl;
b. 如果提取材料为禽类、鸟类、两栖类或更低级生物的抗凝血液,其红细胞为有核细胞,取5-10μl新鲜或冷冻的抗凝血液样品,加入Buffer GTL补足至200μl;
c. 贴壁培养的细胞应先处理为细胞悬液(最大提取量为5×106个细胞),2000rpm(400×g)离心5分钟,弃尽上清,加200μl GTL,振荡至样品彻底悬浮;注意:如需去除RNA,可在上述步骤完成后,加入4μl浓度为100 mg/ml的RNase A溶液(货号:WE0225S),涡旋15秒,室温放置2分钟。
2、加入20μl 蛋白酶K 。
3、加入200μl Buffer GL,涡旋震荡充分混匀,56℃水浴10分钟。
4、短暂离心以去除管盖内壁的水珠。加入200μl无水乙醇,涡旋震荡充分混匀,短暂离心。
注意:
1)加入Buffer GL和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。
2)加入Buffer GL和无水乙醇后可能会产生白色沉淀,不会影响后续实验。一些组织在加入Buffer GL和无水乙醇后可能形成溶胶状产物,此时推荐进行剧烈震荡或涡旋处理。
5、上一个步骤中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱DM中,若一次不能加完溶液,可分多次转入。12000rpm(~~13400 ×g)离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
6、向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇),12000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
7、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇),12000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
注意:如需进一步提高DNA纯度,可重复步骤7。
8、12000rpm离心2分钟,倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟,以彻底晾干。
注意:这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除,乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。
9、将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中,向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μlBuffer GE或灭菌水,室温放置2-5分钟,12000rpm离心1分钟,收集DNA溶液,-20℃保存DNA。
注意:
1)如果下游实验对pH值或EDTA敏感,可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响,若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5(可以用NaOH将水的pH值调到此范围),pH值低于7.0时洗脱效率不高。
2)Buffer GE在65-70℃水浴预热,离心之前室温孵育5分钟可以增加产量;用另外的50-200μl Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。
3)如果要提高DNA的终浓度,可将得到的溶液重新加入到吸附柱中,室温放置2-5分钟,12000rpm离心1分钟;若洗脱体积小于200μl,可以增加DNA的终浓度,但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1μg,推荐用50μl Buffer GE或灭菌水洗脱。
4)因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响,如需长期保存,推荐用Buffer GE洗脱并于-20℃保存。
二、动物组织基因组提取:
1、材料处理
如果提取材料为动物组织,取25 mg(脾组织用量应少于10 mg);如果材料为鼠尾,取一段长度为0.4-0.6 cm的大鼠鼠尾或两段长度为0.4-0.6 cm的小鼠鼠尾。
a. 样本进行液氮研磨或切成小块后置于1.5ml离心管中,加入180μl Buffer GTL,将不同样品做好标记。
b. 若使用匀浆器处理样本,匀浆前向样本中加入不超过80μl Buffer GTL,匀浆后加入100μl Buffer GTL。
注意:
1)确保各组织的量不要超出推荐范围。
2)组织样本在加入Buffer GTL之前用液氮研磨或加入Buffer GTL用匀浆器匀浆处理,可以增加裂解效率。
2、加入20μl 蛋白酶K ,涡旋震荡使样品彻底混匀。56℃水浴,直至组织完全裂解,孵育过程中可每隔一段时间颠倒或震荡离心管使样品分散。
注意:
1)不同组织消化时间不同,通常1-3小时即可完成,鼠尾需要消化6-8小时,必要时过夜消化,不会影响后续操作。
2)如果孵育和涡旋震荡后仍然有胶状物质,延长56℃孵育时间或再加入20μl 蛋白酶K 消化。
3)如需去除RNA,可在上述步骤完成后,加入4μl的浓度为100 mg/ml的RNase A溶液(货号:WE0225S),涡旋15秒,室温放置5-10分钟。
3、加入200μl Buffer GL,涡旋震荡充分混匀,70℃水浴10分钟。短暂离心后加入200μl无水乙醇,涡旋震荡充分混匀。
注意:
1)加入Buffer GL和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。
2)加入Buffer GL和无水乙醇后可能会产生白色沉淀,不会影响后续实验。一些组织(如脾,肺)在加入Buffer GL和无水乙醇后可能形成溶胶状产物,此时推荐进行剧烈震荡或涡旋处理。
4、短暂离心,将步骤3所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱DM中,若一次不能加完溶液,可分多次转入。12000rpm(~~13400×g)离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
5、向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇),12000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
6、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇),12000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
注意:如需进一步提高DNA纯度,可重复步骤6。
7、12000rpm离心2分钟,倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟,以彻底晾干。
注意:这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除,乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。
8、将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中,向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μlBuffer GE或灭菌水,室温放置2-5分钟,12000rpm离心1分钟,收集DNA溶液,-20℃保存DNA。
注意:
1)如果下游实验对pH值或EDTA敏感,可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响,若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5(可以用NaOH将水的pH值调到此范围),pH值低于7.0时洗脱效率不高。
2)Buffer GE在65-70℃水浴预热,离心之前室温孵育5分钟可以增加产量;用另外的50-200μl BufferGE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。
3)如果要提高DNA的终浓度,可将得到的溶液重新加入到吸附柱中,室温放置2-5分钟,12000rpm离心1分钟;若洗脱体积小于200μl,可以增加DNA的终浓度,但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1μg,推荐用50μl Buffer GE或灭菌水洗脱。
4)因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响,如需长期保存,推荐用Buffer GE洗脱并于-20℃保存。
三、细菌基因组提取:
1、细菌样本预处理
a. 革兰氏阴性菌
①取细菌培养物1-5ml(106-108个细胞,最多不超过2×109个细胞)置于离心管(自备)中,12000rpm(~~13400 ×g)离心1分钟,尽量吸净上清。
②向沉淀中加入180μl Buffer GTL,振荡使菌体重悬。
③加入20μl 蛋白酶K ,涡旋混匀,56℃孵育,直至菌体完全裂解,孵育过程中每隔一段时间颠倒或震荡离心管使样本分散。
注意:如需去除RNA,可在上述步骤完成后,加入4μl浓度为100 mg/ml 的RNase A溶液(货号:WE0225S),震荡混匀,室温放置5-10分钟。
④加入200μl Buffer GL,涡旋震荡混匀。
b. 革兰氏阳性菌
①取细菌培养物1-5ml(106-108个细胞,最多不超过2×109个细胞)置于离心管(自备)中,12000rpm离心1分钟,尽量吸净上清。
②加入180μl Enzymatic Lysis Buffer(自备)使菌体重悬。
③37℃孵育30分钟。
④加入20μl 蛋白酶K 涡旋震荡,充分混匀。加入200μl Buffer GL,涡旋震荡混匀。56℃孵育30分钟。
注意:
1)如果需要,95℃孵育15分钟可以使病原体失活,但是95℃孵育会造成一些DNA的降解。
2)如需去除RNA,可在上述步骤完成后,加入4μl浓度为100 mg/ml 的RNase A溶液(货号:WE0225S),震荡混匀,室温放置5-10分钟。
2、加入200μl无水乙醇,涡旋震荡充分混匀。
注意:加入无水乙醇后可能会产生白色沉淀,不会影响后续实验。
3、将步骤2所得溶液(包括形成的沉淀)全部加入到已装入收集管的吸附柱DM中,若一次不能加完溶液,可分多次转入。12000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
4、向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇),12000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
5、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇),12000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
注意:如需进一步提高DNA纯度,可重复步骤5。
6、12000rpm离心2分钟,倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟,以彻底晾干。
注意:这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除,乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。
7、将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中,向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μlBuffer GE或灭菌水,室温放置2-5分钟,12000rpm离心1分钟,收集DNA溶液,-20℃保存DNA。
注意:
1)如果下游实验对pH值或EDTA敏感,可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响,若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5(可以用NaOH将水的pH值调到此范围),pH值低于7.0时洗脱效率不高。
2)Buffer GE在65-70℃水浴预热,离心之前室温孵育5分钟可以增加产量;用另外的50-200μl Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。
3)如果要提高DNA的终浓度,可将得到的溶液重新加入到吸附柱中,室温放置2-5分钟,12000rpm离心1分钟;若洗脱体积小于200μl,可以增加DNA的终浓度,但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1μg,推荐用50μl Buffer GE或灭菌水洗脱。
4)因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响,如需长期保存,推荐用Buffer GE洗脱并于-20℃保存。
储存条件:室温(15~30℃)。
Tricine-SDS-PAGE凝胶制备试剂盒优惠价关键词:Tricine-SDS-PAGE Gel Kit,WE0279,Tricine-SDS-PAGE凝胶制备试剂盒
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