Jackson ImmunoResearch二抗常见应用之Western Blotting

Jackson ImmunoResearch二抗产品久经考验，被众多文献使用认证，专业提供适用于Western Blotting的众多具有种属特异性的二抗品种，包括辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、生物素标记的抗体及链霉亲和素，可用于传统的底物显色及底物化学发光（ECL）的免疫印迹技术。同时，Jackson ImmunoResearch提供覆盖红外光谱范围的多种染料标记二抗，适用于最新的多色图片采集处理系统。

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建议操作稀释范围及PAP复合物

Jackson ImmunoResearch专业提供亲和纯化的辣根过氧化物酶—抗辣根过氧化物酶复合物(PAP)，可用于检测HRP或增强HRP复合物分子的信号。

可溶性PAP复合物	货号	浓度	规格
山羊Goat PAP	123-005-024	20 mg/ml	0.25 ml
老鼠Mouse PAP	223-005-024	20 mg/ml	0.25 ml
兔Rabbit PAP	323-005-024	20 mg/ml	0.25 ml

Jackson ImmunoResearch标记抗体、链霉亲和素及PAP复合物建议稀释范围如下表所示：

产品	化学发光	显色
HRP-Antibody	1:10K - 1:200K	1:5K - 1:100K
Alkaline Phosphatase-Antibody	1:5K - 1:50K	1:5K - 1:50K
Biotin-Antibody	1:20K - 1:400K	1:20K - 1:400K
Alexa Fluor® 680 and 790-Antibody	1:50K - 1:200K	1:50K - 1:200K
HRP-Streptavidin	0.01 - 0.1 μg/mL	1 - 2 μg/mL
Alkaline Phosphatase-Streptavidin	0.1 - 1.0 μg/mL	1 - 2 μg/mL
PAP	1:5K - 1:100K	1:5K - 1:100K

WB适用的荧光染料标记二抗

Alexa Fluor®680是一种激发波长702nm，发射波长684nm的远红外荧光染料。Alexa Fluor®790为激发波长803nm，发射波长783nm的红外发光染料（图1）。由于低荧光猝灭、高消光系数和低的背景荧光，使得抗体结合远红外及红外发光染料比可见光更灵敏。

图1 标记二抗的Alexa Fluor®680（左）和Alexa Fluor®790（右）的激发和发射光谱

远红外及红外荧光染料适用于高灵敏度的免疫印迹，定量免疫印迹（quantitative Western blots），凝胶印迹（in-gel Western blots），微印迹分析（microWestern arrays），in-cell Western arrays，on-cell Western arrays microwestern，组织切片成像，小动物全身成像及其他需要强光的技术。

免疫沉淀后WB实验二抗的选择

针对免疫沉淀后的Western Blotting研究，Jackson可提供特异性针对轻链或Fc片段的抗体，分别检测分子量50kDa及25kDa以上的抗原。当使用特异性标记重链和轻链的二抗，如抗IgG（H+L），进行免疫沉淀后的Western Blotting检测，重链与轻链的分子量大小分别约为50 kDa、25 kDa（图2A）。当使用特异性标记轻链的IgG轻链二抗（图2B）时，仅结合到一抗的轻链上。

图2 使用HRP标记的羊抗鼠IgG（H+L）能够检测出重链（50kDa）及轻链（25kDa）；而使用特异性针对轻链的IgG 轻链二抗，即使在IgG过载的情况下，亦不能够检测出重链。

因此，50kDa左右的蛋白检测为避免重链的干扰，可以选用轻链特异性的二抗，从而将IP或者Co-IP中的面临的重链干扰降到最低；同理，25kDa左右的蛋白检测为避免轻链的干扰，可以选用Fc片段特异性的二抗。

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