TRIplant Reagent多糖多酚植物总RNA抽提试剂

【产品名称】
产品通用名称：核酸提取试剂
产品商用名称: 通用植物总RNA快速提取试剂盒（离心柱型）
【包装规格】
RP3301（50次）/RP3302（100次）
【预期用途】
用于植物样本中总RNA的提取、富集、纯化等步骤。其处理后的产物可用于RNA印迹分析、斑点杂交、poly(A)+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆等。
【检验原理】
针对植物样本开发的特异性裂解液，能高效将RNA和其他植物多糖分开，同时还能有效去除多酚和其他植物次级代谢成份，适合于绝大部分用普通RNA提取试剂盒无法提取的植物，并在近一百多种各类植物（包括十分棘手的松柏类植物）中得到验证。本产品还可以用于富含粘性糖蛋白的动物组织。
【主要组成成分】
试剂盒由裂解液PL，去蛋白液RE,漂洗液RW，RNase-free H₂O，70%乙醇, RNase-free Dnase（可选），10x Reaction Buffer（可选），RNase-free过滤柱，RNase-free吸附柱RA，收集管（2mL）使用说明书和合格证组成。主要组分及储存条件见表 1 。


注：第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
实验所需试剂但未提供的物品：
* 无水乙醇
* β-巯基乙醇(防止褐化现象，非富含多酚类植物可不加)
* 无RNA酶的水或0.5% SDS溶液[调配无RNA酶的水，将水加入无RNA酶的玻璃瓶中，加入DEPC至0.1% (v/v)。放置过夜并高压灭菌。SDS溶液必须用DEPC处理过并经高压灭菌的水配制。

注：每瓶试剂的净含量应不少于标示值。

【储存条件及有效期】
1、漂洗液RW在2-8℃条件下保存，长期保存-20℃条件下保存；裂解液PL在室温储存 , 长期保存-20℃条件下保存；RNase-free Dnase，10×Reaction Buffer在-20℃条件下保存，其他试剂可常温保存。
2、本试剂盒有效期一年，请在有效期内使用。
3、为了避免试剂长时间暴露于空气中发生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
【适用仪器】
本产品可适用于匹配1.5/2.0 mL 离心管的高速冷冻离心机。建议使用升降速较快的离心机，如百泰克CR3180。
【样本要求】
新鲜或保存得当的植物样品。样本采集后尽快实验，可在2~8℃暂时保存；若需长期保存，应置于-80℃环境中。
【使用方法】
事先将裂解液PL 65°C预热，使用前可加入β-巯基乙醇到终浓度0.2%(每1mL裂解液PL加入β-巯基乙醇2μL，防止褐化现象，非富含多酚类植物可不加)。
1．样本处理
取50~100mg植物组织于液氮中研磨，时间要短，要保持研钵中有液氮（如果没有液氮也可以直接加1mL的裂解液PL后匀浆。组织样品容积不能超过PL容积的10%）。
2．转移样品至1.5mL RNase-free离心管中，加入1mL的裂解液PL颠倒混匀，在65°C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。
3．室温条件下12,000rpm 离心5分钟， 小心取上清转入一个新的RNase-free过滤柱中(若上清表面有漂浮物，用枪头跳开吸取下面液体即可)。
4．10,000rpm 离心45秒。收集下滤液(含有总RNA)到一个新的2mL RNase-free离心管中，进行下一步操作。
5．在2mL RNase-free离心管中加入等体积70％乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!），颠倒混匀（此时可能会出现沉淀）。
6．得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中（吸附柱套在收集管内），10,000rpm 离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。（吸附柱RA单次上样量最多700 μL,若样本量大于700 μL需分多次过柱）。
含DNA酶操作步骤
a．加入500μL漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心60秒，弃掉废液。
b．将吸附柱RA放回空收集管中，12,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制酶消化反应。
c．加入已配置好的消化液30μL于吸附膜的中间部位，37℃保温15-30分钟。消化液的配置比例：RNase-Free DNase 2μL，DNase 10×Reaction Buffer 3μL，RNase-Free Water 25μL；RNase-Free DNase的用量可根据DNA量多少来调节，1μLRNase-Free DNase可以消化1μg的RNA，10×Reaction Buffer的量按照比例增减。
d．加入500μL 去蛋白液RE，室温放置2分钟，12,000rpm 离心45秒，弃掉废液。
e．加入700μL漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm 离心60秒，弃掉废液。
不含DNA酶操作步骤

1. 加入500μL去蛋白液RE,12,000 rpm 离心60秒，弃掉废液。
2. 加入700μL漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心60秒，弃掉废液。
3. 加入500μL漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心60秒，弃掉废液。

7．将吸附柱RA放回空收集管中，12,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
8．取出吸附柱RA，放入一个RNase-free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加50-80μL RNase-free water（事先在 65-70℃水浴中加热效果更好）， 室温放置2分钟，12,000 rpm 离心1分钟。如果需要较多RNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟, 或者另外再加30μL RNase-free water，离心1分钟，合并两次洗脱液。

1. 核酸提取效果：

每100mg植物样本预期的RNA产量
1.拟南芥，35μg
2.玉米，25μg
3.烟草，60μg
【注意事项】
1． 为防止RNA降解，所有离心步骤如未加说明，均在4℃低温进行。
2． 裂解液PL和去蛋白液RE中含有刺激性有害化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
3． 预防RNase污染，在实际的操作中应遵循以下指南（参见《分子克隆》）
* 全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。
* 使用灭菌的、一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。
* 使用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时，塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
4． 常规的琼脂糖凝胶电泳和变性胶电泳均可以用来分析RNA的质量。好的RNA产物在电泳后应该可以看到明显的二条优势核糖体RNA带，分别为~5Kb（28S），~2Kb（18S），条带亮度比值约为2：1。有时候也可以看到~0.1kb和0.3Kb(5S，tRNA)带。但有时候根据不同的物种如某些植物组织可以看到4，5条带也属于正常现象，如果RNA未成熟的前体或者不均一核RNA、小核RNA提取出来也可能看到介于7Kb和15Kb之间的不连续的高分子量条带。
5． 检测OD260/OD280吸光度比值时，RNA样品应该溶于TE后检测，如果用水稀释后检测，由于一般水离子强度和PH值低，会使OD280升高，从而使比值降低。
疑难解答：
产量低

1. 样品裂解或者匀浆不彻底
2. 使用的样品或者裂解物在－20℃或者－70℃存放太久。
3. 组织本身含RNA少
4. 超过了吸附柱的最大吸附能力
5. 漂洗液RW内忘记加乙醇

OD260/OD280吸光度比值<1.6

1. 分光光度计检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。低离子浓度和低pH条件下，OD280值会较高，造成比值低。
2. 污染了蛋白或者苯酚

RNA降解，完整性不佳

1. RNA提取所用各种物品和试剂没有灭活RNA酶
2. 样本取出后没有马上处理或冷冻，提取前已经降解
3. 提取的RNA样品没有保存在－20℃或－70℃低温
4. 样品提取过程中降解