PriCells: 小鼠脾脏树突细胞的分离－胶原酶消化制备脾脏细胞悬液价格

服务名称：小鼠脾脏树突细胞的分离－胶原酶消化制备脾脏细胞悬液

提供商：PriCells

规格：1ML

实验材料：

1. 4000U/ml胶原酶D，融化后置于冰上

2. HBSS，已灭菌，含Ca ⁺、Mg ²⁺（购置于Life Technologies）

3. 小鼠脾脏

4. 皮下注射针，22G×1 ^1/2in内径（Becton Dickinson）

5. 10ml、5ml一次性注射器（如Becton Dickinson）

6. 100mm直径培养皿（如Falcon）

7. 2个高压灭菌锅的锯齿状解剖镊（如Roboz）

8. 高压灭菌的不锈钢网：将40目的不锈钢网剪成5cm×5cm的小方格，向下折叠边缘，然后将四边弯成浅的矩形碗；锡箔纸包裹后高压灭菌。

实验方法：

1. 将2管1ml的4000U/ml胶原酶D稀释（足够用于20个脾脏）：1ml加入9ml HBSS（稀释至4000U/ml，步骤8使用），1ml加入39ml的HBSS（稀释至100 U/ml）。置于冰上。

2. 将22G针头连接在10ml的注射器上，充满100 U/ml的胶原酶。将10ml的100 U/ml溶液加入100mm的培养皿中。

3. 取另外一个直径100mm的培养皿进行操作。一只手拿镊子，另一只手拿注射器，拇指放在活塞上。用镊子夹住小鼠脾脏，用针头刺入脾脏被膜的狭窄边缘，注入100 U/ml胶原酶100ml。用镊子将脾脏推向针头，使针头前进几毫米。重复注射胶原酶，继续直到1ml胶原酶都注射入脾脏，针头从另一端刺穿脾脏。

4. 用针头撕开脾脏，将其转移至含胶原酶的培养皿中（步骤2）。重复操作，直到所有脾脏都注射和撕开。

5. 从第二个培养皿中收集细胞悬液加入到置于冰上的50ml离心管中。用3ml 100 U/ml的胶原酶漂洗培养皿后加到上述50ml离心管中。

6. 加入3ml 100 U/ml胶原酶至培养皿中。将撕碎的脾脏依次转移至培养皿。用2个镊子将它们撕成边长1mm的小碎块，使其能通过5ml吸管的内径。当所有的脾脏都撕碎后，将先前放置脾脏碎块的培养皿中的胶原酶溶液加入进来，用5ml吸管猛烈吹打多次。

7. 倾斜培养皿，将大块碎片除开，将细胞悬液转移至第5步的置于冰上的50ml离心管中。用几毫升100 U/ml的胶原酶洗涤培养皿后加入至离心管中。

8. 在培养皿留下的脾脏碎块中加入10ml 400 U/ml的胶原酶。吹打数次后于培养箱里放置30-90min。

9. 在孵育的最后阶段，猛烈吹打碎片，将其吸至直径100mm培养皿的无菌钢网上。

10. 用镊子固定钢网一端，用几毫升100 U/ml胶原酶洗涤碎块，然后用无菌的5ml注射器活塞碾磨碎块。捣烂直到所有的红色物质从组织中去除。再用几毫升100 U/ml胶原酶洗涤钢网。

11. 将钢网从培养皿中拿开，丢弃无色的黏附的被膜碎块。猛烈地吹打培养皿中的液体，将其转移至步骤7的50ml离心管里。用几毫升100 U/ml胶原酶洗涤培养皿后一同加入到离心管中（约有0.5%为树突细胞或者更少）。

12. 如果需要，即可用高密度的BSA离心。

附录：

抗体偶联的绵羊红细胞（EA）：

以PBS洗涤2.5ml收集的绵羊红细胞（Alsever液中提取；Cocalico）3次，每次洗涤后均以350g离心5min。然后用新鲜PBS稀释为5%细胞悬浮液（10 ⁹个细胞/ml）。将高致敏的兔抗红细胞血清于5%细胞悬液以1：50稀释（可能形成亚凝集剂量的抗体）。室温下孵育2h，偶尔温和地颠倒溶液。用RPMI1640（Life Technologies）洗涤形成的EA3次，随后以PBS将EA稀释为5%细胞悬液。于4℃保存2周，使用前再以RPMI洗涤一次。

RPMI-5完全培养基：

RPMI1640培养基（Life Technologies），含有：

5%FBS，56℃热灭活1h

10mmol/L HEPES

20mg/ml硫酸庆大霉素（Life Technologies）

50mmol/ml 2-ME

过滤除菌

高密度BSA溶液：

在1L容量瓶中，加入186ml PBS，29ml 1mol/L NaOH，65ml水（小心操作，注意液体不要再瓶内飞溅）。不要搅拌，将106g BSA（Cohn fraction V，推荐采用完全BSA）铺在溶液表面，盖上锡纸，冷藏过夜，使BSA慢慢溶解。

第二天，温和摇晃已变为澄清、微褐色的溶液；测量折射指数，精确到小数点后第四位。25℃条件下，正确密度的BSA（1.080g/ml）的折射指数在1.384-1.385。为校正折射指数后，用试纸检测pH。pH应在7.0-7.4，一般无需调整。

无菌过滤溶液。将47mm滤膜（Millpore type）置于一个500ml的过滤装置（Nalgene#156-4045）顶部，先以少量BSA润湿滤膜。真空抽滤数分钟，直到BSA滤出为止。取下真空泵，小心将剩余的BSA溶液加入滤器上部的储存器中（避免起泡沫。使用真空泵和滤器过滤剩余的BSA，≥10min）。4℃可保存3个月。

武汉原生原代生物医药科技有限公司（原生原代，PriCells）于2009年成立。位于湖北省武汉市东湖高新技术开发区东湖国家自主创新示范区域，总部设立在武汉国家生物产业基地（即光谷生物城——光谷智慧健康园。

作为中国专业的、专注的研发--生产--销售多种属组织源性细胞产品和提供细胞检测技术服务的生物医药企业，率先独立起草和制定了“基于多种属组织源性细胞分离、培养、运输和检测的PriCells技术流程”的行业专业标准，已被国际权威学术机构认可，被中国的学术机构和企业单位广泛应用。研发和生产的细胞产品主要面向科研院所、生物技术公司、制药企业研发中心和临床医疗机构。

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