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文献和实验
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服务名称 ：磁珠分选柱手工操作分离小鼠CD4+ CD25+抑制性细胞
提供商 ：PriCells
规格 ：10 ML
PriCells: 磁珠分选柱手工操作分离小鼠CD4+ CD25+抑制性细胞
实验材料：
1. 小鼠
2. HBSS洗涤缓冲液
3. MACS缓冲液
4. CD8a（Ly-2）磁珠
5. 结合缓冲液
6. biotin-抗CD25（7D4）
7. Streptavidin-PE
8. 抗PE磁珠
9. 完全RPMI培养基
10. 小鼠CD3 +T细胞富集柱和1×纯化柱缓冲液
11. 15ml离心管，无菌
12. autoMACS系统和分选柱
13. 30mm尼龙网或40mm预分离滤膜
14. 不含气体的MACS缓冲液，4℃（在上样和洗柱过程中保持冰冷）
15. Midi MACS分离磁铁
16. MACS多用支架
17. LD分选柱
18. 15ml离心管，无菌
19. LS分选柱
实验方法：
1. 用20只小鼠的淋巴结制备单细胞悬液并去除红细胞。
2. 将细胞在20mlHBSS洗涤缓冲液中混悬后用血细胞计数器计数。
3. 将细胞悬液在4℃，200g离心10min。离心过程中，准备3支小鼠CD3 +T细胞纯化柱，按说明书的指导用1×纯化柱缓冲液洗3遍。弃洗脱液，在每支纯化柱下方放置一支15ml离心管。
4. 用3ml 1×纯化柱缓冲液和3ml HBSS洗涤缓冲液混悬细胞。将细胞通过30mm尼龙网或40mm预分离滤膜后，每支纯化柱中加入2ml细胞。室温孵育15min。
5. 用2ml 1×纯化柱缓冲液洗涤纯化柱4或5遍以洗脱T细胞。用血细胞计数器计数后，将细胞悬液在4℃，200g离心10min。
6. 将沉淀按每10 8个细胞加0.9ml MACS缓冲液的比例混悬。每10 8个细胞加入0.1ml CD8a（Ly-2）磁珠后4℃孵育15min。
7. 4℃，200g离心10min。
8. 按前述方法制备单细胞悬液，纯化T细胞并加入CD8a（Ly-2）磁珠。
9. 将Midi MACS分离磁铁安装到MACS多用支架上，并将LD分选柱放到磁铁中，每次用3ml 4℃不含气体的MACS缓冲液冲洗分选柱共3次。弃洗脱液，在分选柱下方放置一支新的无菌15ml离心管。
10. 离心结束后弃上清，将沉淀用10 8个细胞/ml的MACS缓冲液彻底混悬。将细胞通过30mm尼龙网或40mm预分离滤膜。用0.1-0.4ml MACS缓冲液冲洗滤网。
11. 将细胞悬液上样到LD分选柱上。
12. 用MACS缓冲液冲洗分离柱每次3ml，共3次。第一个3ml应缓慢加入以免扰动分选柱中的细胞。将洗脱液作为阴性细胞（CD4 + 细胞）保存。
13. 将细胞悬液在4℃，200g离心10min。
14. 用结合缓冲液混悬细胞使其浓度达到10 8个细胞/ml。每10 8个细胞加入15mg biotin-抗CD25（7D4）。4℃孵育15min。4℃，200g离心10min。
15. 用结合缓冲液混悬细胞使其浓度达到10 8个细胞/ml。每10 8个细胞加入7.5mg Streptavidin-PE。4℃孵育15min。
16. 4℃，200g离心10min.
17. 用MACS缓冲液混悬细胞使其浓度达到10 8个细胞/ml。每10 8个细胞加入0.1ml 抗PE磁珠。4℃孵育15min。
18. 4℃，200g离心10min。
19. 按前述方案用结合缓冲液混悬细胞后加入biotin-抗CD25、Streptavidin-PE，以及抗PE磁珠。
20. 用MACS缓冲液混悬细胞使其浓度达到10 8个细胞/ml。
21. 将一支LS分选柱放在Midi MACS分离磁铁上，用MACS缓冲液每次3ml洗3遍LS柱。弃洗脱液，在分选柱下方放置一支新的15ml离心管。
22. 离心结束后弃上清，将沉淀用MACS缓冲液彻底混悬使细胞浓度达到10 8个细胞/ml。
23. 将细胞通过30mm尼龙网或40mm预分离滤膜。用0.1-0.4ml MACS缓冲液冲洗滤网。
24. 将细胞悬液加到LS柱上。
25. 用MACS缓冲液冲洗分离柱每次3ml，共3次。第一个3ml应缓慢加入以免扰动分选柱中的细胞。将洗脱液作为阴性细胞（CD4 + CD25 -细胞）保存。
26. 将分选柱从磁铁上取下。在分离柱中加入5ml MACS缓冲液。将活塞塞进分离柱并洗脱阳性细胞（CD4 + CD25 +细胞）。
27. 将细胞在4℃，200g离心10min。将CD25 +细胞用1-2ml RPMI完全培养基混悬。将CD25 -细胞用10ml RPMI完全培养基混悬。计数。
武汉原生原代生物医药科技有限公司（原生原代，PriCells）于2009年成立。位于湖北省武汉市东湖高新技术开发区东湖国家自主创新示范区域，总部设立在武汉国家生物产业基地（即光谷生物城——光谷智慧健康园。作为中国专业的、专注的研发--生产--销售多种属组织源性细胞产品和提供细胞检测技术服务的生物医药企业，率先独立起草和制定了“基于多种属组织源性细胞分离、培养、运输和检测的PriCells技术流程”的行业专业标 准，已被国际权威学术机构认可，被中国的学术机构和企业单位广泛应用。研发和生产的细胞产品主要面向科研院所、生物技术公司、制药企业研发中心和临床医疗机构。
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