产品详情
文献和实验
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服务名称 ：正常小鼠原代星形胶质细胞培养
提供商 ：PriCells
规格 ：1 SET
PriCells – 正常小鼠原代星形胶质细胞培养
一、实验试剂
1、培养基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement
2、冻存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO
3、洗涤液： 1 × PBS （pH 7.4 ）+ 1% P/S
4、染色液： 0.4% Trypan Blue
5、消化液： PriCells Isolation of Primary Cell Kit
6、检测试剂：抗小鼠CD 11b/c抗体，荧光标记二抗，乙醇bing酮混合液（1：1）
二、实验器械
1、培养皿
2、培养瓶
3、直剪和眼科剪
4、眼科镊和止血钳
5、10ml注射器
6、玻璃滴管
7、烧杯
8、15ml离心管
三、实验流程
取材
↓
去除大脑脑膜及血管,剔除海马部分
↓
1 × PBS （pH 7.4 ）漂洗3次，去掉表层血丝
↓
先用眼科镊将组织撕碎成糜状，用眼科剪反复剪10min，再用移液器轻轻吹打20~30次。
↓
将组织转移至15ml离心管中，加入消化液（PriCells）
↓
将离心管放置到37℃，15-20min水浴恒温消化
↓
加入消化终止液（PriCells）终止反应
↓
离心，1000rmp,10min，弃去上清
↓
重悬，计数细胞
↓
接种密度以1 × 10 6个/ml
↓
培养37℃，5%CO 2
四、实验 操作
1、培养瓶预包被。试验前一天预包培养瓶，置于超静台吹干或45℃烘箱烘干（切记保持无菌），4℃冰箱放置，备用。
2、取材：正常昆明小鼠（生后24h内）。
3、材料预处理：将小鼠处死后浸泡入体积分数75% 乙醇中消毒，以血管钳从后夹住颈部，用眼科剪从枕部向前依次分开头皮及颅骨，再用眼科镊依次剥离，剔除脑膜及血管。取大脑（剔除海马部分）置于1 × PBS （pH 7.4 ）中，漂洗去表层血丝，至脑组织呈乳白色。
4、消化液：用眼科镊将组织撕碎成糜状，再用眼科剪反复剪10min，最后再用移液枪轻轻吹打20~30次，将剪碎的组织用枪转移至15ml离心管中，37℃水浴消化15min。
5、终止消化：按1：1加入消化终止液，中止酶反应。
6、收集重悬细胞：1000 rpm，离心10 min，弃去上清，加入培养液重悬，染色计数细胞。
7、培养细胞密度：调整细胞密度以1 × 10 6个/ml 接种入培养瓶。
8、培养：放置于37℃，5% CO 2培养箱中。
五、细胞鉴定
1、显微鉴定：相差显微镜下，可见细胞呈星形状，细胞密度增高后呈现鹅卵石样镶嵌排列，有接触抑制的特点。细胞具备良好的透光性。
2、免疫组织化学鉴定 ：利用OX-42 （CD 11b/c）免疫荧光染色。
3、细胞爬片。将洗净的盖玻片放入6孔培养板中，接种细胞为3×10 4个/孔，48小时候细胞可以长满，用镊子取出铺满细胞的盖玻片备用。
4、细胞固定：用PBS洗涤细胞，之后放入乙醇bing酮混合液中，固定10min，空气中自然干燥。
5、特异性抗体：按照说明书稀释比要求稀释抗体，加入抗体，放置37℃孵育60min。
6、洗涤：1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤3次 × 15 分钟，晾干。
7、标记性抗体：加入荧光标记抗体，37℃孵育30min。
洗涤：1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤3次 × 15 分钟，晾干。
8、封片：封片剂封片。
9、镜检：荧光显微镜下观察，胶质细胞包质呈现较强黄绿色荧光，细胞核周围尤其明显。
六、注意事项
1、选材注意选取新生昆明小鼠（24h内）。取材过程尽可能保证无菌，尽量剔除脑膜及血管和海马部分。
2、注意尽可能消除脑组织表面的残血，避免血细胞及某些血清成分对胶质细胞贴壁的影响。
3、胶质细胞分离损伤严重影响胶质细胞的生长，因此应严格掌握好酶的消化浓度和消化时间。
4、严格控制胶质细胞培养条件。包括细胞培养用液（培养基，生长因子，血清，抗生素）的质量，浓度。
5、关于培养瓶包被与否，有文献研究显示包被与未包被之间没有特别大的差异。 实验中，可以酌情考虑是否包被。
6、传代培养细胞接种量为1×10 6个（25 cm 2培养瓶），细胞倍增时间为36小时。细胞传代培养最佳为5-8代， 传代次数增加，细胞体积增大，细胞之间间隙增加，细胞贴壁牢固，传代消化时间会有所延长。
七、 PriCells 细胞图片
武汉原生原代生物医药科技有限公司（原生原代，PriCells）于2009年成立。位于湖北省武汉市东湖高新技术开发区东湖国家自主创新示范区域，总部设立在武汉国家生物产业基地（即光谷生物城——光谷智慧健康园。作为中国专业的、专注的研发--生产--销售多种属组织源性细胞产品和提供细胞检测技术服务的生物医药企业，率先独立起草和制定了“基于多种属组织源性细胞分离、培养、运输和检测的PriCells技术流程”的行业专业标 准，已被国际权威学术机构认可，被中国的学术机构和企业单位广泛应用。研发和生产的细胞产品主要面向科研院所、生物技术公司、制药企业研发中心和临床医疗机构。
原生原代（PriCells）—— 细胞产品潜心研发已长达12年
原生原代（PriCells）—— 细胞产品推向市场突破1000余种
原生原代（PriCells）—— 细胞产品使用客户单位突破600余家
原生原代（PriCells）—— 细胞产品学术文章引用累计数突破1180余篇
联系人：曹经理
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