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文献和实验
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服务名称 ：正常大兔原代晶状体上皮细胞培养
提供商 ：PriCells
规格 ：1 KIT
PriCells：正常大兔原代晶状体上皮细胞培养
技术支持 | 浏览次数：224 | 时间：2010-1-15 本文章来源于：武汉原生原代（PriCells）生物医药科技有限公司
PriCells - 正常大兔原代晶状体上皮细胞培养
一、实验试剂
1、培养基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement
2、冻存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO
3、洗涤液： 1 × PBS （pH 7.4 ）+ 1% P/S
4、检测试剂：抗兔Vimentin抗体，荧光标记二抗，乙醇bing酮混合液（1：1）
二、实验器械
1、培养皿
2、培养瓶
3、直剪和眼科剪
4、眼科镊
5、200μl微量移液器及200μl的吸头
6、玻璃滴管
三、实验流程
取材
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清除巩膜外肌肉及结缔组织
↓
将眼球浸入含1×P/S 1 × PBS （pH 7.4 ）浸泡5min
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再用1 × PBS （pH 7.4 ）冲洗3遍
↓
在超净台中环形剪除角膜，放射状剪开并撕除虹膜
↓
用眼科镊尽量靠近赤道部撕下晶体前囊膜
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将前囊膜剪成1mm×1mm大小的碎片
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用吸头吸取组织块接种于培养瓶中，每小块间距0.5cm左右。
↓
翻转培养瓶，瓶底朝上，加入2ml培养基
↓
培养瓶倒置在培养箱中，干贴壁2-4h
↓
培养瓶慢慢翻转平放，继续静置培养，48h后换液
↓
观察到细胞爬出后，将组织块去除
↓
继续放置于37℃，5% CO2培养箱中。
四、实验操作
1、培养瓶预包被。试验前一天预包培养瓶，置于超静台吹干或45℃烘箱烘干（切记保持无菌），4℃冰箱放置，备用。
2、取材：首先在无菌条件下清除巩膜外肌肉及结缔组织后将眼球浸入含1×P/S PBS浸泡5min。
3、材料预处理：用1 × PBS （pH 7.4 ）冲洗3遍，在超净台中环形剪除角膜放射状剪开并撕除虹膜，充分暴露晶状体赤道部，用眼科镊尽量靠近赤道部撕下晶体前囊膜，将前囊膜剪成1mm×1mm大小的碎片。
4、组织贴块：取200μl的吸头一只，在酒精灯上用火焰烧弯。用枪头吸取组织块接种于培养瓶中，每瓶20－25块左右，每小块间距0.5cm左右。
5、贴壁处理：组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内加入2ml左右的培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倒置在培养箱中，干贴壁2-4h。
6、培养：干贴壁完成后，将培养瓶慢慢翻转平放，继续静置培养；48h后换液，更换2-3ml即可。
7、组织块去除：贴块贴壁培养4-7d后，在镜下观察可见大量细胞爬出，用吸管将组织块吹下、去除，继续放置于37℃，5% CO2培养箱中。
五、细胞鉴定
1、显微鉴定：相差显微镜下，可见细胞呈体积较细小呈类圆形透明状。细胞具备良好的透光性，传代后一经贴壁就铺呈多种形态生长。
2、免疫组织化学鉴定 ：利用Vimentin免疫荧光染色检测
3、细胞爬片。将洗净的盖玻片放入6孔培养板中，接种细胞为3×104个/孔，48小时候细胞可以长满，用镊子取出铺满细胞的盖玻片备用。
4、细胞固定：用1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤细胞，之后放入乙醇bing酮混合液中，固定10min，空气中自然干燥。
5、特异性抗体：按照说明书稀释比要求稀释抗体，加入抗体，放置37℃孵育60min。
6、洗涤：1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤3次 × 15 分钟，晾干。
7、标记性抗体：加入荧光标记抗体，37℃孵育30min。
洗涤：1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤3次 × 15 分钟，晾干。
8、封片：封片剂封片。
9、镜检：荧光显微镜下观察。
六、注意事项
1、材料预处理时要注意小心，不要破坏晶状体结构，要注意晶状体前后，确保撕取的是前囊膜。
2、将组织块贴于培养瓶中后，对于培养瓶的移动，翻转，加液等动作一定要轻柔，以免使组织块浮起。
3、去除组织块的时机要选择好，去除过早，细胞数量太少，会使细胞生长速度变慢，去除时间太晚，会使部分区域细胞生长过密，导致细胞老化，影响细胞状态。
4、严格控制上皮细胞培养条件。包括细胞培养用液（培养基，生长因子，血清，抗生素）的质量，浓度。
5、关于培养瓶包被与否，有文献研究显示包被与未包被之间没有特别大的差异。 实验中，可以酌情考虑是否包被。
6、传代培养细胞接种量为5×104个（25 cm2培养瓶），细胞倍增时间为48小时。细胞传代培养最佳为3-5代，5代后晶体上皮细胞明显成纤维细胞化，呈梭形或条状，细胞大小不等，细胞相互分离形成拉网现象，传代消化时间会有所延长。
七、PriCells细胞图片
武汉原生原代生物医药科技有限公司（原生原代，PriCells）于2009年成立。位于湖北省武汉市东湖高新技术开发区东湖国家自主创新示范区域，总部设立在武汉国家生物产业基地（即光谷生物城——光谷智慧健康园。作为中国专业的、专注的研发--生产--销售多种属组织源性细胞产品和提供细胞检测技术服务的生物医药企业，率先独立起草和制定了“基于多种属组织源性细胞分离、培养、运输和检测的PriCells技术流程”的行业专业标 准，已被国际权威学术机构认可，被中国的学术机构和企业单位广泛应用。研发和生产的细胞产品主要面向科研院所、生物技术公司、制药企业研发中心和临床医疗机构。
原生原代（PriCells）—— 细胞产品潜心研发已长达12年
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