PriCells：正常人脐静脉原代内皮细胞培养

一、实验试剂

1、培养基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement

2、冻存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO

3、洗涤液： 1 × PBS （pH 7.4 ）+ 1% P/S

4、染色液： 0.4% Trypan Blue

5、消化液： PriCells Isolation of Primary Cell Kit

6、检测试剂：抗人Ⅷ因子抗体，荧光标记二抗，乙醇bing酮混合液（1：1）

二、实验器械

1、培养皿

2、培养瓶

3、直剪和眼科剪

4、眼科镊和止血钳

5、10ml注射器

6、玻璃滴管

7、烧杯

8、15ml离心管

三、实验流程

取材

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洗涤脐带外血渍,将胶带剪为15cm左右长

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PBS灌洗，去掉淤血

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推注空气，排出残存1 × PBS （pH 7.4 ）

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注射器灌注消化液（PriCells），至另一端有消化液流出时用止血钳截断，继续灌注消化液至血管充盈用另一止血钳截断此端，放置到含抗生素1 × PBS （pH 7.4 ）烧杯中

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烧杯放置到37℃，15-20min水浴 恒温消化，间隔2-3min摇动

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收集消化液，用培养基洗涤静脉3-4次，3ml/次，之后加入消化终止液（PriCells）反应

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离心，1000rmp,10min，弃去上清

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重悬，计数细胞

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接种密度以5 × 105个/ml

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培养37℃，5%CO2

四、实验操作

1、培养瓶预包被。试验前一天预包培养瓶，置于超静台吹干或45℃烘箱烘干（切记保持无菌），4℃冰箱放置，备用。

2、取材：正常分娩胎儿脐带，长15-20cm。

3、材料预处理：将获取的血管放入含有1% P/S的1 × PBS （pH 7.4 ）中反复洗涤，去除脐带外部的血渍，之后用注射器吸取洗涤液反复灌住冲洗脐带静脉血管，至血管内无血渍，洗涤液澄清为止。

4、消化液：用注射器关注空气推注入血管中，排出残余洗涤液，在从血管一端开口处注入消化液，当另一开口端有消化液流出即可用止血钳结扎血管，继续灌注消化液，到血管充盈为止，同样用止血钳截流血管，放入含无菌PBS的烧杯中37℃水浴消化30min。

5、终止消化：去掉止血钳，让酶液流入预先准备好的培养皿中，按1：1加入消化终止液，中止酶反应，用培养基灌注血管清洗3次。

6、收集重悬细胞：收集中止后的消化液于离心管中，1000 rpm，离心10 min，弃去上清，加入培养液重悬，染色计数细胞。

7、培养细胞密度：调整细胞密度以5 × 105个/ml 接种入培养瓶。

8、培养：放置于37℃，5% CO2培养箱中。

五、细胞鉴定

1、显微鉴定：相差显微镜下，可见细胞呈梭状，细胞密度增高后呈现鹅卵石样镶嵌排列，有接触抑制的特点。细胞具备良好的透光性。

2、免疫组织化学鉴定 ：利用Ⅷ因子相关抗原检测（或利用CD31和CD33免疫荧光染色鉴别内皮细胞）。

3、细胞爬片。将洗净的盖玻片放入6孔培养板中，接种细胞为3×104个/孔，48小时候细胞可以长满，用镊子取出

铺满细胞的盖玻片备用。

4、细胞固定：用PBS洗涤细胞，之后放入乙醇bing酮混合液中，固定10min，空气中自然干燥。

5、特异性抗体：按照说明书稀释比要求稀释抗体，加入抗体，放置37℃孵育60min。

6、洗涤：1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤3次 × 15 分钟，晾干。

7、标记性抗体：加入荧光标记抗体，37℃孵育30min。

洗涤：1 × PBS （pH 7.4 ）洗涤3次 × 15 分钟，晾干。

8、封片：封片剂封片。

9、镜检：荧光显微镜下观察，内皮细胞包质呈现较强黄绿色荧光，细胞核周围尤其明显。

六、注意事项

1、选材注意选取圆润饱满无扭曲变形的脐带，脐带血管中无血块凝固阻塞，脐带长度大于15cm。取材过程尽可能保证无菌，若距离实验室比较远，可以将获取的脐带先用含有抗生素的PBS洗涤去除残血，之后浸泡到此洗涤液中，低温冰盒带回实验室。

2、注意尽可能消除血管内的残血，避免血细胞及某些血清成分对内皮细胞贴壁的影响。

3、内皮细胞分离损伤严重影响内皮细胞的生长，因此应严格掌握好酶的消化浓度和消化时间。

4、严格控制内皮细胞培养条件。包括细胞培养用液（培养基，生长因子，血清，抗生素）的质量，浓度。

5、关于培养瓶包被与否，有文献研究显示包被与未包被之间没有特别大的差异。 实验中，可以酌情考虑是否包被。

6、传代培养细胞接种量为5×104个（25 cm2培养瓶），细胞倍增时间为48小时。细胞传代培养最佳为5-8代， 传代次数增加，细胞体积增大，细胞之间间隙增加，细胞贴壁牢固，传代消化时间会有所延长。

七、PriCells细胞图片