病毒在疾病研究中的应用

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服务名称 :病毒在疾病研究中的应用

提供商 :OBiO和元生物


病毒在疾病研究中的应用

疾病关键靶点筛选与验证服务

一、sgRNA和shRNA文库构建与病毒包装

1、CRISPR/Cas9是新出现的一种由RNA指导Cas9核酸酶对靶基因进行特定DNA修饰的技术。和元生物引进了全套的人和小鼠的sgRNA文库,可以用于高通量筛选,同时Cas9有SaCas9和SpCas9两种,便于选择。

2、作为RNA干扰实验的重要一步,shRNA表达载体的构建关乎着整个RNA干扰实验的成败。和元生物的RNAi载体有多种选择性,不仅可以包装成不同种类的病毒,且含有多种启动子和筛选标记。

3、病毒包装:sgRNA和shRNA都可以包装成病毒,并应用于细胞水平和动物模型上。

慢病毒(Lentivirus):是一种RNA病毒,改造自人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒载体。可利用逆转录病毒酶将外源基因整合到基因组中实现稳定长久表达。

腺相关病毒(AAV):是一种单链DNA病毒,具有广泛的宿主范围以及细胞和组织感染能力,并且以伴随体状态存在于细胞内,进行不依赖于宿主细胞活性的基因表达。

二、局部或整体病毒给药

1、获得sgRNA或shRNA病毒后,选择何种方式进行注射也是实验的关键。注射方法分为整体注射和局部注射。整体注射包括尾静脉注射、肌肉注射、腹腔注射和灌胃给药,局部注射主要是脑定位注射。

2、获得sgRNA或shRNA病毒后,选择何种方式进行注射也是实验的关键。注射方法分为整体注射和局部注射。整体注射包括尾静脉注射、肌肉注射、腹腔注射和灌胃给药,局部注射主要是脑定位注射。

尾静脉注射:将血液、药液、营养液等液体物质直接注射到动物尾静脉中的给药方式。

皮下注射:一种常用的药物注射治疗方法,指将药液通过注射器注入皮下组织内,达到治病的目的。

腹腔注射:一种常用的给药方式,通常是在动物麻醉后,将药物注入其胃肠道浆膜以外的区域。

灌胃给药:药理毒理实验中常用的给药方式。将动物固定,使用灌胃器,将药液由动物口直接注入到动物胃中。

脑定位注射:通过立体定位仪,实现对动物脑部精准定位,以便在非直视暴露下对其进行病毒或者药物定向注射。

尾静脉注射 肌肉注射 腹腔注射 灌胃注射 脑定位注射
尾静脉注射 皮下注射 腹腔注射 灌胃注射 脑定位注射

三、表型分析和细胞基因组鉴定

病毒注射之后,观察sgRNA或shRNA的导入对细胞表型和基因组的影响。细胞表型检测包括细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移与侵袭等实验。

四、潜在靶点的细胞生物学分析和机制研究

1、转录活性分析:通过常用启动子活性检测来实现,即构建荧光素酶报告载体观察荧光的强度,以检测转录因子和其靶启动子之间的调控关系。

1、转录活性分析:通过常用启动子活性检测来实现,即构建荧光素酶报告载体观察荧光的强度,以检测转录因子和其靶启动子之间的调控关系。

2、蛋白-DNA结合验证:较多采用染色质免疫沉淀技术(CHIP)来实现,它是用于研究体内DNA与蛋白质相互作用关系的方法。

3、蛋白-RNA结合验证:常用RNA免疫沉淀(RIP)验证,其原理与CHIP相近,是用来研究与蛋白质结合的RNA在基因表达调控中的作用。

4、蛋白-蛋白结合验证:研究蛋白质之间相互作用主要用GST Pull-down和免疫共沉淀技术(Co-IP)。

疾病自发模型制备服务

一、利用基因组编辑、基因干扰及基因表达技术模拟基因组或基因表达异常

二、模型动物的饲养,生理监控和病理分析

1、配备IVC标准动物饲养笼,饲养符合SPF级别的小动物,构建各种动物模型,如裸鼠皮下成瘤、I/II型糖尿病模型、肝硬化模型、心肌梗塞模型等。

2、利用小动物生理检测装置,如小动物呼吸机、血压仪、无创监护仪等,监测血氧饱和度、血压、心率、动物体温、呼吸频率、呼吸幅度、脉波幅度等。

3、临床前组织病理学检测,如石蜡切片制作、H&E染色、特殊染色、免疫组化及结果分析与评价。

三、基于自发模型的机制研究和药物筛选

肿瘤的形成是一个比较复杂的过程,可能由多基因突变引起的,比如肺癌模型(p53、Kras、Lkb1)、乳腺癌(TP53、BRCA1、BRCA2)、肝癌(Foxm1b)。通过基因组编辑或shRNA对这些关键基因进行修饰或干扰,得到自发成瘤模型。建立模型后,可以进行药物筛选,也可以通过这些模型发掘出其他的目标靶点。


面向基因治疗的病毒工具研发和制备服务

一、针对特殊细胞类型的病毒衣壳定向工程开发

腺相关病毒(AAV)作为载体进行基因治疗已经越来越受人们的青睐,但是如何提高AAV靶向性和转染效率是人们期盼解决的一道难题。目前对AAV衣壳蛋白进行定向开发,可以明显提高其转导效率和靶向性。改变方法包括:AAV衣壳蛋白氨基酸的定点突变、人工插入碱基改造衣壳蛋白基因的修饰等。


二、细胞和组织特异性启动子筛选和载体构建

研究不同的细胞和组织,需要找到对应的特异性marker,一般可以通过RNA表达谱分析、蛋白组学分析、Q-PCR验证、ELISA检测等方法可以得到marker。获得marker中的启动子序列后,根据实验目的,设计符合实验目的的载体,并将启动子序列构建到该载体上,进行一系列的克隆实验。


三、临床应用级别病毒载体的生产(GMP生产条件,自动化生产工艺)

1、GMP,即“生产质量管理规范”或“良好作业规范”、“优良制造标准”。GMP是一套适用于制药行业的强制性标准,要求制药、食品等生产企业应具备良好的生产设备,合理的生产过程,完善的质量管理和严格的检测系统,确保最终产品质量符合法规要求。

2、自动化生产线是指按照工艺过程,把一条生产线上的仪器联结起来,形成能自动控制、自动测量和自动连续的生产线。自动化生产线的好处包括:

1)较低的直接劳动参与;2)较高的生产率

3)较低的产品成本,因为设备的固定成本由大量的产品平摊了。

生产过程自动化系统不仅能够采集和处理信息,还能自动调节各种设备,优化生产。在必要时,工厂操作员可以中止自动化系统,进行手动操作。

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