慢病毒包装

服务名称 ：慢病毒包装

提供商 ：上海源兹生物科技有限公司

规格 ：病毒+对照病毒

一、服务介绍
慢病毒包装是慢病毒（Lentivirus）载体的构建过程重要的一环。慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。
二、实验原理
慢病毒属于逆转录病毒科，但其基因组结构复杂，除 gag、pol和env这3个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外，还包括4个辅助基因，vif、vpr、nef、vpu和2个调节基因tat和rev。HIV-21 是慢病毒中最具特征性的病毒，第一个慢病毒载体系统即以此病毒为基础进行构建的。慢病毒载体的构建原理就是将HIV-21基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列)和编码反式作用蛋白的序列进行分离。载体系统包括包装成分和载体成分：包装成分由HIV-21基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补，含有包装、逆转录和整合所需的HIV-21顺式作用序列。同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒(RCV)的可能性，将包装成分的5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子，3′LTR换成 SV-40 polyA 位点等。将包装成分分别构建在两个质粒上，即一个表达gag和pol、另一个表达env。
三、实验流程

1. 第一天，胰酶消化293T细胞（消化要充分，要将细胞充分吹散，传至25代后不要在用来包病毒），血球计数板计数，1500rpm离心3min，用新鲜的DMEM完全培养基重悬细胞，按适当比例铺10cm平皿，每皿培养基体积为10ml，置于37°C，5%CO₂培养箱中培养，待第二天细胞密度达到80%-90%，即可进行质粒转染
2. 第二天上午9:00-10:00，观察并确定细胞密度，开始质粒转染。按1:1:1的比例将过表达骨架质粒、包装质粒、包膜质粒溶于1500μl的opti-MEM中，轻柔混匀后，室温放置5min；将适当比例的转染试剂PEI同样溶于1500μl的opti-MEM中，轻柔混匀后，室温放置5min；将静置5min后的质粒和转染试剂轻柔混合，室温放置20min，然后将混合液加入细胞密度达到80%-90%的培养皿中，轻轻混匀，不要将细胞吹起，置于37°C，5%CO₂培养箱中培养
3. 8h后，即第二天下午17:00-18:00，吸弃培养皿中混有质粒的培养基，加入10ml新鲜的含有2%FBS的DMEM培养基，置于37°C，5%CO₂培养箱中继续培养
4. 第三天上午8:30-9:00，每个培养皿中加入丁酸钠溶液，4h后，即中午12:30-13:00，弃去培养皿中培养基，加入10ml新鲜的含有2%FBS的DMEM培养基，置于37°C，5%CO₂培养箱中继续培，24h
5. 24h后，即第四天中午12:30-13:00，收细胞上清于50ml离心管中（此为第一批病毒原液），置于4°C，每皿细胞继续加入10ml新鲜的含有2%FBS的DMEM培养基，置于37°C，5%CO₂培养箱中再培养24h
6. 再过24h后，即第五天中午12:30-13:00，收细胞上清于前一天所用的50ml离心管中将第二批病毒原液与第一批混合，4°C，4000rpm离心20min，用0.45μm滤器过滤
7. 将病毒原液装进专用离心管中，按照超高速低温离心机使用方法操作离心机，4°C，30000rpm离心2h。弃上清，静置2-3min左右，吸走多余液体；加入1mlPBS溶解病毒沉淀，收集于1.5ml EP管中，置于4°C过夜溶解，将病毒液分装，保存于-80°C。

四、服务说明
1. 客户提供：
基因名称及所需药品。
2. 公司提供：
基本实验步骤、病毒液、数据分析结果、剩余药品，另外本公司还提供实验过程中所用的耗材、仪器设备和操作过程的说明清单一份。
3. 实验周期：
4-5周左右，具体需要根据细胞生长情况及实验内容而定。
五、质量承诺
提供清晰的图片、检测数据、病毒液和分析结果。
公司实验结果展示：
慢病毒包装（包装感染293T细胞图片）