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shRNA表达载体构建好后，即可进行RNA干扰主体实验。

RNA干扰主体实验的重点在于:

1. 成功将shRNA表达载体导入目的细胞。

   如果目的细胞的质粒转染效率较低(低于70%) ，则应采用腺病毒或慢病毒载体，利用病毒载体的高感染率、高表达特性，以更好地开展RNA干扰主体实验。

2. 设置好分组和对照。

   详情见【TIPS : RNA干扰实验中的对照】。

3. RNA干扰效率的检测(体外)。

   一般应该从mRNA水平、蛋白质水平、细胞表型水平三个层次来检测干扰效率。

   • mRNA 水平：RT-PCR、Real-Time PCR；
   • 蛋白质水平Westem-Blot、ELISA 、免疫组化；
   • 细胞表型水平MTT、克隆形成实验、流式细胞检测、细胞小室实验等。
4. RNA干扰效率在动物模型上的进一步验证(体内)。

   动物模型实验同以采取"体内法"和"体外法"。

   体内法，即先做裸鼠成瘤模型，再将质粒或病毒导入裸鼠，检测RNA干扰效果。此法操作复杂，对质粒和病毒产品的质和量要求都较高，但是比较贴近实际，说服力较显著。

   体外法，即先将质粒或病毒导入肿瘤细胞，再将肿瘤细胞导入动物体内，然后检测阳RNA干扰效果。此法操作较简单，对质粒和病毒产品的质量要求较低。

TIPS:RNA干扰实验中的对照

按照nature的标准，一个严格的RNAi介导knockdown实验要有6个对照:

1. 转染试剂对照（监控转染及培养条件对结果的影响）；
2. nonsense siRNA对照（监控外源核酸本身对结果的影响）；
3. positive siRNA对照（监控假阴性）；
4. 技术重复对照（也叫off-target 对照，也就是利用至少2个靶点的siRNA同时实验，2个siRNA互为off-target control，当两者的表型相同时，才有可能是特异性的knockdown效应）；
5. rescue对照（knockdown之后做超表达，看是否有性状的逆转，这也是为了说明knockdown的特异性）；
6. 全表达组扫描对照（即转录/表达芯片扫描，以最终确定表型不是由于off-target造成）。

实际实验中，全表达组扫描对照很少有文献涉及。其它几个对照中，①、②两种对照即所谓的空白细胞对照、NC对照，基本是所有杂志都要求具备的。④、⑤两种对照， 主要是为了解决off-target效应，选做一种即可， 一般建议选⑤，涉及的实验即所谓的“RNA干扰回复实验”，本公司针对这一实验，有专门的“RNA干扰回复实验套餐”，详情请参见相关内容。