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提供商 :上海中科新生命生物科技有限公司
——即蛋白质药物的HPLC纯度测定技术服务用高效液相色谱(HPLC)的方法,根据蛋白质保留时间的差异分离蛋白质,通过峰面积积分测定蛋白质的纯度。利用样品中各组分在色谱柱内借助于固定相及流动相的某种物理、化学作用在固定相与流动相之间分配行为的不同来进行分离的,其分离机制有吸附、分配、离子交换、分子排阻、疏水作用、亲和力等,而色谱柱是色谱分离系统的核心部分,装有不同类型填料的色谱柱与相对应的流动相形成不同分离机制,对绝大多数的有机化合物进行分离分析。
“HPLC法测定蛋白质类药物的纯度,是一项基本的生物化学分析技术”
技术指标
◆ 样品要求:
蛋白或肽的总浓度不低于0.5μg/μl,体积不少于50μl,并标明准确浓度,如果需要脱盐及样品浓缩的需要,请说明并标明缓冲液成分。
◆ 测定参数:
样品相对分子质量 | 蛋白质/多肽 | 检测波长 (nm) | 纯度分析方法 | 色谱柱 | 上样量 (μg) |
M≤6,000 | 多肽 | 214 | 反相色谱分析法 | Agilent, ZORBAX Eclipse XDB-C18 | 5 |
6,000<M≤120,000 | 蛋白质 | 280 | 反相色谱分析法 | Agilent, ZORBAX 300SB-C8 | 100 |
分子筛色谱分析法 | TSK gel G3000SW, 05789 | 50 | |||
M>120,000 | 蛋白质 | 280 | 反相色谱分析法 | Agilent, ZORBAX 300SB-C3 | 100 |
分子筛色谱分析法 | TSK gel G3000SW, 05789 | 50 |
案例分析
◆ 反相HPLC纯度方法实验参数:
流动相A:0.1%三氟乙酸的水溶液;流动相B:0.1%三氟乙酸的yijing溶液;流速:1ml/min;柱温:30℃;梯度洗脱:70min(A液从97% ~ 30%,B液从3% ~ 70%);检测波长为214nm。
结果谱图:
图为胰岛素标准品在反相HPLC柱上的纯度分析图谱
◆ 分子筛HPLC纯度方法实验参数:
流动相:100% 0.1M PB+0.1M NaCL,pH7.0;流速:0.5ml/min;等度洗脱:30min;柱温:30℃;检测波长为214nm。
图为胰岛素标准品在GSK 3000sw柱上的分析图谱(分子筛)
Q&A
分子筛色谱以多孔凝胶作为固定相,依据样品分子量大小达到分离目的。大分子不进入凝胶孔洞,沿多孔凝胶胶粒间隙流出,先被洗脱;小分子进入大部分凝胶孔洞,在柱中被强滞留,后被洗脱。
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