二硫键检测

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提供商 :上海中科新生命生物科技有限公司

——即蛋白质药物的二硫键配对分析技术服务

二硫键是重要的蛋白质翻译后修饰形式,也是一种比较特殊的修饰。蛋白质通过各种链间和链内的半胱氨酸连接在一起,对蛋白质分子保持正确的高级结构,维持必要的生物活性至关重要。因此在蛋白质类药物的生物化学分析中,二硫键一直是关心的重点。
利用质谱分析二硫键,以前由于二硫键多肽分子的二级质谱图非常复杂,质谱分析需要大量人工进行,费时费力且不能准确有效。而现代生物质谱学在最近十年发展非常迅速,大为提高了对蛋白质分子的定性定量和翻译后修饰的分析能力。
APT结合蛋白质溶液内的非还原酶解和LC-MS/MS,对供试品的二硫键配对方式进行分析,明确供试品的各种链内和链间二硫键配对方式,并提供确定这些二硫键配对方式的实验证据,包括一级和二级质谱数据等。



“蛋白质类药物的二硫键配对组成是非常重要的理化性质”

技术指标
本方法所检测的样品是蛋白质或多肽类供试品,测量的是二硫键所在多肽分子的分子量,测定的是该多肽分子的氨基酸序列和二硫键配对方式。蛋白质或者多肽供试品既可以是固体样品,也可以是溶液样品,供试品量不应少于200μg。供试品如果为固体,应为蛋白质多肽冻干制品;如果为液体,样品中蛋白质多肽浓度应尽可能在2mg/ml以上。
本方法检测是二硫键配对方式和其所在多肽分子的氨基酸序列。二硫键所在多肽分子的分子量与理论值相差小于2 Da,其二级碎片分子量与理论值相差小于0.8 Da。对还原前后的二硫键所在多肽分子做色谱质谱图分析(XICs),其信号峰面积需有显著差异。
二硫键测定方法所使用的仪器是,Thermo公司和GE公司生产的高校液相串联质谱仪LTQ-Velos质谱仪和Ettan MDLC色谱系统。
案例分析
下图显示一个还原前后的蛋白质药物的二硫键分析图谱(XIC of LC-MS/MS)。

图为还原前后的蛋白质药物的二硫键分析图谱(XIC of LC-MS/MS)
下图为蛋白质类供试品二硫键组成分析的MS/MS图谱。

图为蛋白质类供试品二硫键组成分析的MS/MS图谱
Q&A
Item Value
Type of Search MS/MS Ion Search
Enzyme Chymotrypsin / Trypsin
Gluc / Trypsin
Mass Values Average
Max Missed Cleavages 4
Variable Modifications Oxidation (M)
Iodoacetamide / Carbamidomethyl of C
Peptide Tolerance 2 Da
MS2 Tolerance 0.8 Da
Fragmentation CID

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