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提供商 :上海中科新生命生物科技有限公司
——即蛋白质药物的氨基酸组成分析技术服务蛋白质药物的氨基酸组成分析是应用高效液相色谱法对经过水解的蛋白质所得氨基酸进行高效、灵敏、快速的定量分析。蛋白质在6 mol HCL中真空状态下经过110℃/24h水解完全形成游离氨基酸,再通过异硫氰酸苯酯(PITC)对所得氨基酸衍生化,用高效液相色谱对所得的衍生产物进行梯度洗脱,使得不同氨基酸衍生物分离开来,通过外标法对每个氨基酸衍生物的含量进行测定,进而得知蛋白质样品中氨基酸的含量信息。
“氨基酸组成分析是蛋白质类药物临床前理化性质分析的必做项目之一”
技术指标
● 样品要求:
供试品为多肽蛋白固体样品,总量应不少于4mg,干燥未潮解;
供试品为多肽蛋白液体样品,浓度应不低于1mg/ml,多肽蛋白总量应不少于4mg,且透明澄清、无混浊、无沉淀。
● 设备特性和色谱参数:
HPLC仪器:高效液相色谱仪(SHIMADZU,HPLC LC-20A);
色谱柱:氨基酸分析柱(Dikma,Diamonsil AAA(5u 250mm×4.6mm));
检测器:紫外检测器;检测波长:254nm;流速:1ml/min;
相关液相梯度如下:0-39分钟,B液线性梯度从5%-48%;39-40分钟,B液线性梯度从48%-100%;40-45分钟,B液维持在100%。
异硫氰酸苯酯(PITC)衍生法原理示意图
氨基酸标准品进行PTIC分析的HPLC图谱
案例分析
● 蛋白质类供试品的氨基酸组成分析
流速:1ml/min;检测波长254nm;柱温:30℃。
A液为50mM乙酸钠水溶液(pH 6.5);B液为 甲醇:Yi Jing:水=2:6:2混合溶液。
洗脱梯度:
时间(min) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0 | 95 | 5 |
39 | 52 | 48 |
40 | 0 | 100 |
45 | 0 | 100 |
46 | 95 | 5 |
60 | 95 | 5 |
蛋白质类供试品进行PTIC法测定氨基酸组成的HPLC图谱
Q&A
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