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提供商 :上海中科新生命生物科技有限公司
——即蛋白质药物氨基酸序列覆盖率技术服务蛋白质多肽类药物往往拥有很长的氨基酸序列,在传统蛋白质化学领域,对这些分子进行序列分析需要进行诸如Edman降解法等的化学分析。但是,对于大多数蛋白质药物样品而言,化学测序方法都不能完成对整个氨基酸序列的覆盖(Edman降解法的测序极限,根据文献是70个氨基酸左右,APT为客户完成过50个氨基酸测序工作)。然而蛋白质类药物的理化性质分析中需要氨基酸序列的覆盖率信息,用以完善蛋白质类药物的理化性质信息。APT为客户提供基于shotgun方法的蛋白质多肽类药物的氨基酸序列覆盖率测定服务。
上图为shotgun方法的nano-spray离子源,可以用来使酶解后多肽分子电离,被质谱仪所分析。
“蛋白质类药物的覆盖率测定从方法学上类似于蛋白质组学的shotgun法”
技术指标
质谱方法对蛋白质多肽药物分子的肽段覆盖率进行分析的基本原理是将蛋白质分子选用特异性蛋白酶进行切割,酶解后的供试品为复杂的肽段组成的混合物,然后经过液相联用质谱仪进行检测。APT为提高质谱仪对肽段覆盖率的检测,采用Trypsin、Chymotrypsin、GluC三种酶切以提高覆盖率。
APT采用LTQ-Velos质谱仪(Thermo Finnigan, San Jose, CA)进行质谱分析。进样方式:Microspray;毛细管温度:200℃;检测方式:正离子;多肽和多肽碎片的质量电荷比按下列方法采集:每次全扫描(full scan)后采集20个碎片图谱(MS2 scan)。
LTQ-Velos产生的原始数据由Bioworks 3.3软件查库,搜索使用数据库为根据样品理论序列建立的蛋白库,数据筛选参数为:Xcorr ≥ 1.9(Charge 1),Xcorr ≥ 2.2(Charge 2)和Xcorr ≥ 3.75(Charge 3)。APT采用标准是二级质谱覆盖到的肽段覆盖率。
“多种蛋白质内切酶联合酶解,有利于提高氨基酸序列的覆盖率。”
“对于抗体样品的覆盖率实验,脱糖后分析有利于提高覆盖率。”
案例分析
由质谱结果(下图)可以看出三种酶酶切均较为充分。查库结果进行整合之后,最终得到该供试品轻、重链各自的覆盖率。
本供试品(下图)轻链氨基酸序列共有XXX个残基,匹配到的氨基酸残基序列共计XXX个残基,匹配到的序列占总序列的XX%。
供试品轻链的覆盖率(红色部分)
本供试品(下图)重链氨基酸序列共有XXX个残基,匹配到的氨基酸残基序列共计XXX个残基,匹配到的序列占总序列的XX%。
供试品重链的覆盖率(红色部分)
Q&A
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