普林斯顿 BIG BAC DNA 分离试剂盒

PSIΨ CLONE BIG BAC DNA 分离试剂盒


该试剂盒可梯度用于25-250mL的培养物(OD600Η4-6)，10倍梯度(1mL试剂/每10mL培养物)用于重悬、中和、裂解和获取基质反应物。获取的基质反应物被直接加到裂解物中，去除染色体DNA。再将此混合物倒入多用柱子，进行清洗和洗脱。每个柱子的清洗和洗脱缓冲液也是梯度的。试剂可供250mL培养物的分离，其中包括5个空柱子。

试剂盒组分
重悬缓冲液（1） 25 ml
裂解液（2） 25 ml
中和缓冲液（3） 25 ml
BAC DNA结合树脂缓冲液（4） 2瓶 25 ml
清洗缓冲液（5） 80 ml
洗脱缓冲液（6） 10 ml
RNA 酶A 5.0mg (2 x 2.5mg0 Vial
洗脱柱 5



除了再悬浮缓冲和所有组件核糖核酸酶可能是储存在室温下。在添加核糖核酸酶再悬浮缓冲、存储4 ℃条件。

PSI Clone Big BAC DNA试剂盒操作方法（适用于25-250mL培养物）产品号PP-121


本操作方法是为了从30mL LB(含有12.5 ug/mL氯霉素)培养物中分离模板级BACDNA而设计，培养物的OD600在4.0-6.0之间。通常产量为5-7 ug DNA。

使用10倍梯度调整可变的培养物体积。例如：过夜培养物如果为30mL OD600 4.0，离心之后，要重悬在3mL的重悬缓冲液(含100ug/mL RNAse A)中，然后是3mL的裂解缓冲液，3mL中和缓冲液。

1. 将1mL重悬缓冲液加入到RNAse A管中溶解RNAse A，然后再将其加回到重悬缓冲液中，混匀。
2. 在细胞沉淀中加入3mL重悬缓冲液，轻轻地吹打，使其悬浮。
加3mL裂解缓冲液，轻轻上下倒转混匀。室温裂解5分钟。
4. 加3mL中和缓冲液，轻轻上下倒转混匀，直到浓重的白色沉淀形成，冰上孵育20分钟。
5. 25,000 x g离心30分钟( 使用SS-34转子或等同转子)澄清裂解物。将裂解物移到一干净试管中，如裂解物不澄清，混匀，再离心。
6. 在澄清的裂解物中加3mL BAC结合树脂，倒转几次，室温孵育10分钟，(每2分钟倒转一次)。将该溶液倒入柱子的桶中，控干。
7. 加3 x 5mL清洗缓冲液，控干，将柱子放到一个空50mL锥型管(Falcon管或相关试管)中，去除过量的清洗缓冲液，在平板式离心机上750 x g离心2分钟，弃掉清洗液。
8. 将1mL洗脱缓冲液加入到柱子中，孵育2分钟，按上述方法离心(使用一个新管)，然后再重复洗脱一次。
9. 如前所述，加1倍体积的异丙醇，混匀、沉淀DNA、20,000 x g离心30分钟。去除上清，加入2mL70%乙醇，混匀洗涤DNA。离心去除过量的70%乙醇，风干约5分钟。
10. 将沉淀重悬于适当的TE或选择的低盐缓冲液中。