免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒-20T价格_品牌:万类生物-丁香通官网

保存条件：4℃及-20℃

规格：20T

万类生物试剂促销：试剂盒8折优惠，免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒-20T 原价1460元，现价1168元。

产品名称：免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒

产品概述：免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）是研究蛋白质间相互作用的一种常用方法,基本原理是以细胞内源性靶蛋白为诱饵，将靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行共孵育，促进免疫复合物的形成；随后加入能够与抗体Fc段结合的prorein A+G，形成“结合蛋白-靶蛋白-靶蛋白抗体-protein A+G小珠”复合物，纯化该复合物后凝胶电泳分离蛋白，应用Western blot或者质谱技术鉴定靶蛋白的结合蛋白。

包装信息：

保存日期：本试剂盒自订购之日起一年内有效。

注意事项：
1. 裂解细胞时，为防止蛋白降解，所有的操作尽量在冰上进行。
2. 测定蛋白浓度时，样品中若含有EDTA、EGTA、DTT、硫酸铵和脂类会影响检测结果。
3. 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀，确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生。
4. Protein A+G离心时，离心力不易过高，会损坏Protein A+G，离心力在3000-5000×g即可。

操作流程：
1. 除去细胞培养基，用预冷的PBS（需自备）洗涤细胞两次。
2. 加入预冷的裂解液(见表1)，冰育5min。

3. 用预冷的细胞刮将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5ml EP管中，缓慢晃动10min。
4. 4℃，14000×g离心15min，将上清转移至新的离心管中。
5. 准备Protein A+G，用1ml PBS清洗三次（3000×g离心1min）后保存备用，此步骤可提前准备。

6. 每1ml总蛋白中加入60μl Protein A+G，以去除非特异性杂蛋白，降低背景。

7. 4℃，14000×g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A+G。

8. 做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度。

① 配制工作液：根据标准品和样品数量，按50体积试剂A加1体积试剂B(50：1)配制适量工作液，充分混匀。

② 稀释标准品：取10μl标准品稀释到100μl，使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0、1、2、4、 8、12、16、20μl加到96孔板的蛋白标准品孔中，再用PBS补足至20μl。
③ 加适当体积样品到96孔板的样品孔中，再用PBS溶液补足至20μl。
④ 向各孔加入200μl工作液，37℃放置30min(也可室温放置2h)。
⑤ 用酶标仪测定A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，如果目的蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）。

10. 加入2μg抗体到500μl总蛋白中，用摇床缓慢摇动抗原抗体混合物，4℃过夜。

11. 加入60μl Protein A+G来捕捉抗原抗体复合物，室温缓慢摇动抗原抗体混合物2h。

12. 用预冷 PBS清洗三次（3000×g离心1min），收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，弃上清。

13. 用20μl 5×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定。

14. 将上样样品煮沸5min，以游离抗原，抗体，珠子，3000×g离心1min，收集上清，也可以暂时于-20℃保存，留待以后电泳，电泳前应再次煮沸5min。