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文献和实验
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保存条件 :-20℃保存,避免反复冻融。
保质期 :有效期1年
英文名 :Animal Tissue Direct PCR Kit
库存 :大量
供应商 :翌圣生物科技(上海)股份有限公司
CAS号 :点击查看
规格 :50T
动物组织直接PCR试剂盒是一款可直接对不同动物组织进行PCR扩增的试剂盒,适应性广、稳定性强。试剂盒采用独特的裂解缓冲液体系,可以快速的裂解多种动物组织样品并释放出基因组DNA,不需要除去蛋白、RNA等,即可将释放出的基因组DNA作为模板直接用于PCR反应。此外,样品使用量少,低至5 mg动物组织即可进行实验。
本试剂盒中提供的 2x Tissue Master Mix具有很强的扩增兼容性,能直接以待测样品裂解液为模板,进行高效特异性扩增。该试剂为2倍浓缩PCR反应混合液,包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分,大大简化操作过程,降低污染几率。该试剂盒可用于转基因型鉴定、动物基因分型等。
产品组分
类别 | 编号 | 组分 | 产品编号/规格 | 储存 | |
10180ES50(50T) | 10180ES70(200T) | ||||
Part I | 10180-A | Buffer AL | 5mL | 20mL | 室温或4℃ |
10180-B | Protease | 220μL | 880μL | 4℃ | |
10180-C | 6× DNA Loading Buffera | 375μL | 1.5mL | 4℃或-20℃ | |
Part II | 10180-D | 2× Tissue Master Mixb | 500μL | 2 × 1mL | -20℃ |
b)2× Tissue Master Mix:包含Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂以及稳定剂等。
运输方法
冰袋运输。
保存方法
1. 试剂10180-A【Buffer AL】,在常温干燥条件下,可保存12个月,如需保存更长时间可置于4℃。低温保存,易出现沉淀,可平衡至室温或37℃水浴10min,待沉淀溶解后,混匀使用。2. 试剂10180-B【Protease】,具有独特配方,为保证其更好的活性和稳定性,建议4℃保存,切勿置于-20℃。
3. 试剂10180-C【6× DNA Loading Buffer】,可置于4℃或-20℃长期保存。
4. 试剂10180-D【2× Tissue Master Mix】,-20℃保存,避免反复冻融。
操作方法
样品基因组DNA释放1. 在离心管中加入100μL Buffer AL,4μL Protease,轻轻涡旋混匀。
【注】:Buffer AL与Protease混合后尽快使用,不宜长期保存。
2. 取5-10mg动物组织,置于上述离心管中,轻轻涡旋混匀。
【注】:组织应尽量剪碎,以便酶解反应更顺利进行。
3. 65℃孵育10-30min,然后95℃处理5min。
【注】:65℃孵育,一般10min即可满足多数PCR需求。若需要的DNA量较大或样品较难酶解,可将时间延长至30min。组织块不需完全酶解,残余的部分在后续离心步骤中可被除去。
4. 12000rpm离心5min。
5. 将上清转移至新的离心管,4℃或-20℃保存或直接用于PCR扩增。
PCR反应鉴定——PCR反应体系
组分 | 体积(μL) | 体积(μL) | 终浓度 |
2× Tissue Master Mix | 10 | 25 | 1× |
Forward Primer (10μM) | 0.5 | 1 | 0.2-0.25μM |
Reverse Primer (10μM) | 0.5 | 1 | 0.2-0.25μM |
裂解产物(DNA模板) | 2 | 5 | - |
ddH2O | To 20 | To 50 | - |
a)模板使用量:建议1-10%总体系。避免超过总体系的20%。
b)引物终浓度:0.2-0.25μM可以得到较好结果。反应性能较差时,可在0.1-0.5μM范围内调整引物浓度。
c)反应体系:推荐使用20μL或50μL,以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
d)体系配制:配制好PCR反应体系,置于涡旋仪上涡旋混匀,瞬时离心将反应液集于管底。
e)对照反应:建议进行PCR时,设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。
PCR反应鉴定——PCR反应条件
循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 94℃ | 5min | 1 |
变性 | 94℃ | 10sec | 30-40 |
退火 | 50-65℃ | 20sec | |
延伸 | 72℃ | 30sec/kb | |
终延伸 | 72℃ | 5min | 1 |
b)延伸时间:需要根据片段的长度来确定,对于1kb以内的DNA片段,建议延长时间为30sec。
注意事项
1. 建议使用新鲜采取的动物组织,若为长期冷冻组织,应尽量避免反复冻融,否则会导致模板的降解,影响PCR效率。2. 试剂Buffer AL若低温保存,易产生沉淀。在使用前务必将其在室温中放置一段时间,也可在37℃水浴中预热10min,以溶解沉淀,混匀后再使用。
3. 电泳检测时,切勿使用含有SDS的Loading Buffer。否则,电泳时会在泳道中出现一大团拖尾亮带,影响实验结果。
4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
常见问题与解决方法
常见问题 | 可能原因 | 解决方法 |
阳性对照、待测样本均无条带。 | PCR反应体系或反应条件不合适。 | 使用梯度PCR摸索PCR最佳反应条件。 |
PCR试剂保存不当失去活性。 | 2× PCR Mix应保存于-20℃,使用时避免反复冻融。若使用频繁,可在4℃短时间存放。 | |
引物设计问题。 | 尝试重新设计引物进行检查。 | |
阳性对照有目的条带,待测样本无条带或条带弱。 | 不当储存或长期储存引起试剂活性丧失。 | 使用新鲜的试剂。 |
加入组织裂解液过量。 | 增大反应体系,或减少裂解液的用量。 | |
样本裂解混合液保存不当或保存时间过久,DNA基因组已经降解。 | 裂解混合液液可在4℃保存2-3天,尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。 | |
模板加入量不适合。 | 在反应体系10-20%范围内优化模板加入量。反应效性能较差时,可以降模板浓度调节到低于10%的范围。 | |
PCR循环数不足。 | 适当增加PCR的循环数,推荐在35-40循环为佳。因为模板复杂,一般PCR反应要比用纯化的 DNA模板多5-10个循环为佳。 | |
非特异性扩增 | PCR退火温度太低,循环数、引物浓度或模板浓度太高。 | 增加PCR退火温度,降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。 |
PCR引物错配。 | 重新设计PCR引物。 | |
配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。 | PCR反应体系的配制在低温下进行,配制完成后尽快进行PCR扩增反应。 | |
阴性对照出现目的条带 | 操作工具或试剂污染。 | 实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 |
样本间交叉污染。 | 每个取样器只对一个样本使用;或取完一个样本后,将取样器刃口浸入2%的NaClO溶液中,反复涮洗,然后用干净的纸巾擦干残液。 |
翌圣生物科技(上海)股份有限公司
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