酶联斑点（Elispot）实验服务

服务名称 ：酶联斑点（Elispot）实验

提供商 ：晶莱生物

规格 ：实验服务

酶联斑点（Elispot）技术概述 ：
酶联斑点（Elispot）全名为酶联免疫斑点检测，英文：Enzyme-linked Immunospot Assay。它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。其技术原理，一句话概括就是：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。

1、实验的准备工作

(1) 设备与耗材：

① 超净工作台;

② 5% CO2 37°C 细胞培养箱;

③ P20， P200， P1000 微量移液器;

④ P300 8通道微量移液器，P300 12通道微量移液器;

⑤ Biosys ELISPOT Reader

⑥ P20， P200， P1000 枪头;

⑦ 多道移液器吸槽;

⑧ 0.5mL，1.5mL EP管。

(2)溶液配制

① PBS： 用分析纯试剂，Millipore级别的纯水配制，高压灭菌。

② PBST： PBS加入0.05% Tween-20，注意无菌操作。储存于20-25°C，可存放一个月。

③ 70%乙醇：分析纯乙醇70mL，加入Millipore级别的纯水至100mL。

④ 30%乙醇：分析纯乙醇30mL，加入Millipore级别的纯水至100mL。

⑤ 包被抗体(coating antibody，Primary antibody)：照U-Cytech说明书，加入双蒸水溶解。使用时，用PBS稀释50倍，每孔50μL。

⑥ 封闭液：用PBS将试剂盒中的封闭存储液(Blocking stock solution R)稀释10倍，每孔200μL。

⑦ 抗体稀释液：注意，只是用来稀释检测抗体和酶联亲和素。用PBS将试剂盒中的稀释存储液(Dilution buffer R)稀释10倍

⑧ 检测抗体(Biotinylated detector antibody，Secondary antibody)：照U-Cytech说明书，加入双蒸水溶解。使用时，用抗体稀释液稀释100倍，每孔100μL。

⑨ 酶联亲和素(Streptavidin-HRP conjugate)：照U-Cytech说明书，加入双蒸水溶解。使用时，用抗体稀释液稀释100倍，每孔100μL。

⑩ AEC显色液： 照U-Cytech说明书，用100mL 30%乙醇溶解底物缓冲液胶囊(Substrate buffer capsule)，然后加入3.3mL AEC储存液(AEC stock solution)，混合均匀后10mL每支分装，-20oC保存。使用时，解冻，每孔加入100μL。

⑪ PHA刺激物： 将储存液(2mg/ml， Murex)分装成20μL/EP管，-20°C长期冻存。使用时，加入980μL U-Cytech无血清培养基(或者1640基本培养基)，成为工作液(40μg/mL，10倍终浓度)，每孔加入10μL，终浓度4μg/mL。

⑫ U-Cytech无血清培养基：我们推荐无血清ELISPOT技术，它能排除血清的干扰，结果更加稳定可靠，背景也更好。如果没有，可以用含10% 血清的1640培养基代替。

2、ELISPOT标准操作程序

(1)第一天：ELISPOT包被程序

设计好试验，把每个孔要加入的内容做成卡片，到时候就会从容很多。

每孔加入15μL 70%的乙醇预湿30秒。

注意：

① 未润湿的PVDF膜是洁白的、不透明的，经过乙醇润湿之后，颜色变暗，变成半透明状，很容易观察二者的区别。

② 加乙醇的时候，枪头应该靠在孔壁接近孔底的地方，注意枪头不到刺到PVDF膜。

③ 有时候，加入的乙醇挂在孔壁上，这时要盖上板盖，轻轻叩击，让乙醇顺势滑落。乙醇一旦接触到PVDF膜，就会在表面张力和毛细作用之下迅速浸润整块膜，使得膜的颜色和透明度发生变化。

④ 15μL是经过优化的体积，它能保证刚好完全浸润整块膜，而不会有剩余。如果加大使用量，乙醇溶液就会透过膜而积存在膜的背面，加深实验的背景。

⑤ 加入100μL去离子水洗涤三次，尽量减少乙醇的残留。

⑥ 按照试剂盒的使用说明，将包被抗体储存液稀释在PBS缓冲液中，每孔加入50μL，4°C包被过夜。

⑦ (次日)倾倒包被液，用PBS洗涤5次，最后一次，在灭菌的吸水纸上扣干。

⑧ 加入200μL试剂盒自带的稀释好的封闭液，37°C封闭1小时。

⑨ 倾倒封闭液，无须洗涤，直接可以进行细胞培养。(也可以用PBS缓冲液或者纯水洗涤一次，拍干，封口，4°C保存，可以在4°C保存数周。)

(2)第二天：铺细胞，加入刺激物，培养

① 整个实验设置一组正对照(PHA刺激)，每一个细胞样品(同一个捐献者或者实验动物)要设一个负对照(不加刺激物)，整块板还要加一个背景负对照(不含细胞，只加培养基和所有的检测试剂)。

② 填好实验卡片，用以指导实验的安排和细胞及试剂的添加。每一个细胞/刺激物的组合设置2-4个孔的重复(想要有统计学的意义，每个细胞/刺激物设4 个孔的重复)。

④ 取出封闭好的板，准备加入细胞。如果是以前做的封闭，可以加入200μL的U-Cytech无血清培养基，室温静置10分钟，倾倒，然后再重复一次。

⑤ 按照实验卡片的安排，加入不同浓度的细胞，100μL/well，细胞在孔中的分布要尽量均匀(要诀是加入细胞之后，不要再震动或者拍击 ELISPOT板。有人认为拍击板子会让细胞更分散，实际情况刚好相反)。正对照的细胞浓度为1x105/well，实验组的样品细胞浓度请自行调整。

⑥ 加入100μL的U-Cytech无血清培养基到背景负对照孔。

⑦ 正对照孔加入10μL PHA，终浓度4ug/mL，该浓度能有效刺激IFN-γ的分泌。

⑧ 加入实验者自己的刺激物(配制成10X终浓度，10μL/well)到实验孔。加完刺激物之后不要再拍击ELISPOT板。有人认为拍击板子会让刺激物在孔中混合均匀，实际上，通过扩散，刺激物也会很快混合均匀。拍击板子会让细胞成圈的分布在孔的外周。

⑨ 当加完所有的样品之后，盖上板盖，放入二氧化碳培养箱，37°C培养18-24小时。注意在整个培养过程中避免移动、碰撞培养板。为了取得更好的结果，甚至开关培养箱的箱门也应该禁止。因为碰撞会造成细胞的移位，造成斑点的模糊、拖尾。

(3) 第三天：培养后操作

① 倾倒孔内的细胞及培养基。

② 低渗法将细胞裂解，每孔加入200μL冰冷的去离子水，将板置于冰上冰浴10分钟。

③ 每孔用200μLPBST洗涤10遍，洗涤最后一遍之后，将板倒扣在吸水纸上拍干。

④ 按照试剂盒说明的浓度，用抗体稀释液稀释检测抗体，每孔加入100μL生物素标记的检测抗体，37°C 1小时。

⑤ 每孔用200μL PBST洗涤5遍，洗涤最后一遍时，将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下，同时洗涤膜的正反两面，盖上保护层，将板倒扣在吸水纸上拍干。

注意：

① 洗涤膜的背面，我们摸索出的办法是，在一个浅托盘中盛上干净的PBST，将膜板的底面浸入，轻轻摇晃几次即可。注意，一定要将膜的背面和塑料保护层上的液体甩干之后，再合拢，盖上，不要伤害到膜。

② 按照试剂盒说明的浓度，用抗体稀释液稀释酶标的链霉亲和素，每孔加入100μL，37°C 1小时。

③ 每孔用200μL PBST洗涤5遍，洗涤最后一遍时，将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下，同时洗涤膜的正反两面，盖上保护层，将板倒扣在吸水纸上拍干。

④ 照试剂盒的说明，解冻已配好的AEC显色液。每孔加入100μL的显色液，室温静置20-30分钟，注意避光。

⑤ 待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置 10-30分钟，让膜自然晾干。注意不要将板放到烤箱内，防止膜发脆、破裂。

⑥ 将ELISPPOT板置于Biosys Bioreader4000 PRO自动读板仪内，调节好合适的参数，半点计数，并记录斑点的各种参数，作统计分析。

晶莱生物服务流程


晶莱生物实验服务项目

动物实验	细胞生物学	病理实验
消化系统模型	细胞培养	病理染色
胃酸分泌模型	普通细胞株	HE染色
脓毒症模型	细胞缺氧培养	油红O染色
胃溃疡模型	细胞培养+支架	番红固绿染色
胰腺炎模型	干细胞培养	Masson染色
肝纤维化模型	原代细胞分离/提取/培养	天狼猩红染色
DIO肥胖模型	细胞转染/病毒感染	PAS糖原染色
胆结石模型	Trans well共培养	阿利新蓝染色
结肠炎(UC)模型	细胞增殖	甲苯胺蓝染色
脂肪肝模型	细胞计数	尼氏染色
急性肝损伤模型	生长曲线测定	LFB髓鞘染色
免疫、代谢系统疾病模型	存活曲线测定	普鲁士蓝染色
骨质疏松模型	ccK-8增殖检测	VG染色
糖尿病模型	MTT增殖检测	EVG染色
高尿酸血症模型	CFSE检测增殖-流式检测	VonKossa染色
呼吸系统模型	BrDU检测-免疫荧光法	刚果红染色
肺纤维化模型	细胞凋亡	苏丹黑B染色
慢性肺阻塞模型	Annexin V/PI流式检测细胞凋亡	Trap染色
急性肺损伤模型	WB检测凋亡相关蛋白	抗酸染色
哮喘模型	透射电镜观察凋亡小体	革兰氏染色
肺栓塞模型	Tunel染色(POD法,DAB显色)	AB-PAS染色
支气管炎模型	Tunel(荧光法,含试剂盒)	亚甲基蓝染色
泌尿生殖系统模型	DNA ladder法	苯胺蓝染色
慢性肾衰模型	细胞周期	荧光 DAPI染色
急性肾衰模型	细胞显微计数	普鲁士蓝染色
肾间质纤维化模型	PI染色	间苯二酚碱性品红染色
肾结石模型	BrdU渗入法	银染
肾炎模型	免疫荧光染色	黑色素染色
子宫内膜异位症模型	PI流式检测细胞周期	镀银染色
心血管系统模型	细胞运动	PASM 六胺银染色
冠心病模型	Transwell检测细胞迁移	VG染色
心肌梗死模型	Transwell检测细胞侵袭	富尔根染色
心脏骤停模型	细胞划痕	亚甲基蓝染色
慢性心力衰竭模型	细胞克隆	碘-碘化钾染色
动脉粥样硬化模型	集落形成法/稀释铺板方法	Goldner三色法染色
白血病模型	软琼脂克隆法	PAS-萘酚磺S染色
高血压模型	毛细管克隆法	改良苯酚品红染色
神经系统模型	体外实验血管生成	网状纤维染色
脑卒中模型	磁珠分选细胞	β-半乳糖苷酶染色
栓塞性脑梗死模型	流式分选细胞	镀银染色
脑出血模型	开机费	movat五色染色
脑损伤模型	单色	维多利亚蓝染色
脊髓损伤模型	双色	免疫组化
帕金森模型	CBA多细胞因子流式检测	免疫组化预式
老年痴呆模型	组织/血液细胞制备	免疫组化正式
应激模型	组织单细胞制备	免疫荧光（石蜡-单标）
骨骼疾病模型	中性粒细胞提取	免疫荧光（石蜡-双标）
骨折模型	其他样本细胞制备（如血液等）	免疫荧光（石蜡-三标）
骨缺损模型	外周血PBMC分离	免疫荧光（冰冻-单标）
风湿免疫性关节炎模型	线粒体组学	免疫荧光（冰冻-双标）
骨关节炎模型	线粒体膜电位检测-流式法	制片前处理
五官疾病模型	线粒体膜电位检测-免疫荧光法	石蜡组织包埋
眼科疾病模型	线粒体ROS生物含量检测--流式	特殊包埋（细胞、材料、眼球等）
鼻腔疾病模型	线粒体ROS生物含量检测--免疫荧光	软化（肝硬化、皮肤结痂、植物等）
皮肤疾病模型	线粒体通透性转换孔（mPTP）	骨组织脱钙（小）
皮肤损伤模型	溶酶体免疫荧光法	骨组织脱钙（大）
肿瘤疾病模型	线粒体+溶酶体共定位	骨组织EDTA脱钙（小）
原位瘤模型	内质网	骨组织EDTA脱钙（大）
转移瘤模型	线粒体钙瞬时变化检测-流式	石蜡白片
皮下植瘤模型	ATP检测	细胞爬片
	ADP检测
	AMP检测
流式	DNA/RNA半定量检测	基因编辑工具
组织细胞悬液处理	pcr检测mRNA	合成（3保1）片段/质粒/引物合成
细胞处理	microRNA检测	质粒载体构建
血液标本处理	LncRNA表达量的检测	过表达腺病毒载体构建包装
细胞刺激培养	CirRNA表达量的检测	shRNA腺病毒载体构建包装
单色检测	凝胶电泳	过表达慢病毒载体构建包装
双色检测	基因合成	shRNA慢病毒载体构建包装
Annexin V/PI凋亡	＜300	过表达腺相关病毒载体构建包装
细胞周期	300-1,500	shRNA腺病毒载体构建包装
	1500 - 5000	稳转细胞株
	>5000
	特殊序列
ELISA	WB	qPCR
组织匀浆处理	蛋白提取及定量一	RNA抽提
ELISA（不含试剂盒）48T/kit	WB检测一（10孔膜/指标）	mRNA引物设计及合成
ELISA（不含试剂盒）96T/kit	灰度值分析及作图一（10孔膜/指标）	miRNA引物设计及合成
ELISA（含国产试剂盒）48T/kit	蛋白提取及定量二	LncRNA引物设计及合成
ELISA（含国产试剂盒）96T/kit	WB检测二（10孔膜/指标）	CircRNA引物设计及合成
	灰度值分析及作图二（10孔膜/指标）	mRNA RT-qPCR
		miRNA RT-qPCR
		LncRNA RT-qPCR
		CircRNA RT-qPCR

收费标准/服务周期/提供结果：
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