流式凋亡检测

服务名称 ：流式凋亡检测

提供商 ：锐赛生物

流式凋亡检测

Apoptosis Detection

实验原理

细胞凋亡（Cell apoptosis）是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下的损伤，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。

细胞凋亡检测的方法很多，我们采用的Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡的原理：磷脂酰丝氨酸（Phosphatidyl serine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行EGFP融合、荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针。

实验流程

实验结果展示

图1 采用流式细胞仪Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡

碘化丙啶(Propidine lodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但可进入凋亡中晚期的细胞和死细胞，而使细胞核红染。Annexin V/PI　双染法检测细胞凋亡，可以将凋亡早期的细胞和凋亡晚期以及死细胞区分开。

技术应用

细胞凋亡研究不仅受到基础医学界的重视,也日益受到临床医学领域的青睐。通过检测药物、基因或蛋白对细胞凋亡及凋亡调控基因的影响,在肿瘤防治、老年痴呆、艾滋病、自身免疫病,心肌梗塞等研究上都发挥着积极的作用。

实验流程

实验结果展示

图1 采用流式细胞仪Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡

TROUBLESHOOTING

常见问题FAQ

Q :常用的细胞凋亡的检测种类有哪些?
A :凋亡检测方法有数十种之多,主要可以分为以下几大类: 1) DNA水平,检测凋亡时基因组DNA的变化; 2)蛋白水平,主要检测凋亡时线粒体和死亡受体两大凋亡通路的变化; 3)细胞膜/细胞器膜水平,主要检测凋亡时细胞膜成分或者膜电位的变化; 4)超微结构,主要检测凋亡时亚细胞结构的变化。这些方法各有优缺点,必须结合具体的实验目的,实验条件以及实验处理来选择合适的分析手段。

Q :常见的细胞凋亡检测方法及优缺点比较?

方法	优点	缺点
Anexin VPI双染法: Annexin v可结合凋亡细胞外翻的PS 蛋白。	可以准确的进行凋亡细胞的计数。	反应完毕后需在一小时内检测，贴壁细胞吹打处理要轻柔，防止机械损伤对实验结果的影响。不能用于组织样本。
Sub G1 峰检测： 凋亡细胞DNA含量的流式细胞计划分析，分析DBA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。	适用性广，操作方便。	对实验操作及实验结果的分析能力要求较高。不能用于组织样本。
TUNRL法： 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产 生大量的粘性3‘ -OH末端，可在脱氧 核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用 下，对DNA的3’ 末端进行荧光剂标记。	原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，特别适用于组织样本的凋亡研究。	操作要求高，组织样本需要固定，固定方式不好可能导致背景高、信号弱。
Caspase等凋亡通路蛋白的WB检测：未活化前以酶原形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段被剪切激活，可裂解相应的胞浆、胞核底物，最终导致细胞凋亡。	WB检测方便快捷，实验结果相对直观，可进行半定量检测。	注意购买质量好的抗体并优化检测条件。

Q: Annexin V/PI双染实验的四个象限分别代表什么?

	PI	Annexin V	代表细胞群
LL象限	-	-	正常细胞
LR象限	-	+	早期凋亡细胞
UR象限	+	+	晚期凋亡细胞或者坏事细胞
UL象限	+	-	理论上不会出现细胞；若出现有可能是操作过程中受到损害的细胞或是FACS仪器参数设置不当

A:根据费光情况划分四个象限(见图7.6) ,横坐标代表绿色荧光(Annexin V为FITC绿色荧光标记),纵坐标代表Pl红色荧光,四个象限分别命名为LL, LR, UR, UL,由于Pl不能穿过未凋亡细胞和凋亡早期细胞的细胞膜,而Annexin V可以检测到凋亡早期外翻的PS,因此四个象限代表了不同的细胞群。

图7.6流式四象限图

Q:流式上机检测细胞凋亡每次所需要的细胞量大概是多少?
A:靶细胞接种到6孔板中进行前期药物处理/转染/感染后备用。对于个体比较大的细胞,依据实际细胞密度,使用150pxt培养血培养细胞,最终进行检测需要10^5-10^6个细胞。

参考文献

1. Vermes I, C, Steffens-Nakken H,et al. A novel assay for apoptosis. FIow cytometric detection ofphosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J Immunol Methods 1995,184(1):39-51.

2. K o o pman G, Reutelingsperger CP, Kuijten GA, et al . Annexin V for flow cytometric of phosphatidylserineexpression on B cells undergoing apoptosis. BIood 1994, 84(5):1415-1420.