CRISPR慢病毒包装

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CRISPR慢病毒系统

CRISPR慢病毒为纯化慢病毒，高纯度可直接用于动物体内实验，感染效率高。

CRISPR慢病毒系统包括两个载体：

1）gRNA慢病毒载体

gRNA慢病毒载体由慢病毒基因组序列和细菌质粒序列构成。细菌质粒序列含有一个Ampicillin抗性基因和一个高拷贝复制子pUCori。慢病毒基因组序列是从元件5’LTR开始，到3’LTR结束。

慢病毒基因组序列可容纳两个外源基因表达盒子：一个是目的基因表达盒子，另外一个是marker基因表达盒子。Marker基因表达盒子已经克隆在载体上，无需重新构建。我们提供了荧光marker、抗药性marker或者荧光/抗药性双marker供您选择。gRNA表达盒子则包括三部分序列：U6启动子、gRNA和终止子。U6启动子已经克隆在载体上，每次构建载体，只需通过annealing-ligation技术将感兴趣的gRNA打靶序列克隆到载体上即可。gRNA打靶序列与gRNA scaffold序列构成一个完整的gRNA。

克隆方法

我们采用引物退火连接的克隆方法，将gRNA克隆到慢病毒骨架上。

我们的CRISPR/Cas9慢病毒载体使用了human U6 promoter转录gRNA。gRNA被Cas9识别，与基因组序列结合，从而引起Cas9对基因组序列的剪切。剪切效率取决于gRNA 是否只与目标基因组序列特异性100%匹配。目标序列的选择还需要考虑下游有PAM特征的序列。您可以登陆vectorbuilder.com选择感兴趣的人、小鼠和大鼠的9RNA进行载体设计。

2）Cas9慢病毒载体

Cas9慢病毒载体利用CBh启动子共表达humanized Cas9基因和Hygromycin抗药性基因。gRNA慢病毒载体利用U6 promoter表达gRNA，同时携带了一个表达抗药性基因的基因表达盒子。在设计gRNA慢病毒载体时，请选择非Hygromycin抗药性基因（Puromycin、Neomycin和Blasticidin），两个载体需要不同的抗药性基因配套使用才能起到药筛的效果。