产品详情
文献和实验
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注册证号 ：-
保存条件 ：-20℃冰冻保存
保质期 ：24个月
英文名 ：MALBAC® Single Cell WGA Kit
库存 ：≥50盒
供应商 ：亿康基因
CAS号 ：-
规格 ：50rxns
亿康基因MALBAC®单细胞全基因组扩增试剂盒是基于哈佛大学MALBAC专利技术，能够在4小时内，从单细胞或者等量DNA中有效扩增出2-5µg的全基因组DNA。本试剂盒也可用于其它DNA模板量有限的情况，例如少于百个细胞或低于ng级的DNA。对于大多数的哺乳动物细胞，例如单个胚胎卵裂球、极体、单细胞、精子等，本试剂盒均可获得96%以上的扩增成功率，并可实现AT-GC富集区的成功扩增。现已成功用于肿瘤，神经，生殖，干细胞，宏基因组学等领域。
产品原理
本产品可实现高度均一的全基因组扩增，其核心技术为 多次退火环状循环扩增（MALBAC）技术 [1]，该技术 利用独特的具有链置换活性的 DNA 聚合酶进行准线性的全基因组预扩增，再通过 PCR 技术进行指数式扩增， 为下游分析提供充足的实验材料。
规格成分
| 组分 | 标签名 | YK001B |
| 细胞裂解液（不包含酶） | Cell Lysis Buffer | 300μL |
| 细胞裂解酶 | Cell Lysis Enzyme | 30μL |
| 预扩增缓冲液 | Pre-Amp Buffer | 750μL |
| 预扩增酶 | Pre-Amp Enzyme Mix | 50μL |
| 扩增缓冲液 | Amplification Buffer | 750μL |
| 扩增酶 | Amp Enzyme Mix | 40μL |
储存条件
-20℃储存，二十四个月。可以按需求进行分装冻存，避免反复冻融。预期用途
本产品可用于单细胞或其他微量样本中 DNA 提取和全基因组扩增，扩增产物可用于实时定量 PCR、高通量测 序等技术平台。本试剂盒的扩增产物也可用于多种下游实验： 基因点突变分析检测 单核苷酸多态性（SNP）基因分型 基因拷贝数（CNV）分析 微阵列比较基因组杂交（Array CGH）SNP 芯片技术
注意事项
本产品仅供科学研究使用，不得用于临床医学诊断及其他非合理用途。
安全信息
使用本试剂盒进行实验操作时，请穿着实验防护服，戴好一次性手套和防护眼镜，务必做好生物安全防护措施。 如需更多安全信息，请查阅材料安全数据表。
需要用户准备的材料
可从流式分选出的细胞或 0.5pg级 DNA 中扩增出全基因组 DNA，且成功率达 95% 以上； 可在 AT-GC 富集区得到准确、高重复度的连续扩增结果；
全基因组覆盖度高，仅存在 <10% 的等位基因丢失。
| 序号 | 名称 | 序号 | 名称 |
| 1 | 无核酸酶水 | 6 | 微型离心机 |
| 2 | 1.5mL,200μL 离心管 | 7 | 漩涡混和仪 |
| 3 | 移液器 | 8 | 紫外分光光度计 |
| 4 | 移液器吸头 | 9 | PCR 仪 |
| 5 | 1×PBS 缓冲液 |
产品特点
单细胞经扩增后可获得 2~5µg的 DNA 产物； 单管操作、3 步完成、仅需 4 小时、中间产物无需纯化；可从流式分选出的细胞或 0.5pg级 DNA 中扩增出全基因组 DNA，且成功率达 95% 以上； 可在 AT-GC 富集区得到准确、高重复度的连续扩增结果；
全基因组覆盖度高，仅存在 <10% 的等位基因丢失。
适用领域
MALBAC 单细胞全基因组扩增试剂盒的适用范围十分广泛，多种原始材料和微量样本均可通过该试剂盒进行全 基因组扩增，包括基因组 DNA、新鲜或干燥的血液、新鲜或冷冻的组织、司法痕量物证等材料。本产品适用的领域有： 人和动物研究；生物标志物研究（CNVs、SNVs） 体外受精胚胎植入前基因筛查和诊断 （PGS/PGD）； 转基因动物基因分型； 胚胎和干细胞单精子、卵细胞研究，神经元细胞等研究，肿瘤研究，体细胞遗传变异分析，肿瘤进化和发展， 肿瘤干细胞， 循环肿瘤细胞 (CTCs)；微生物研究 宏基因组学研究 微生物基因分型
样本要求
1. 样本起始量
本试剂盒是针对单细胞的全基因组扩增设计的，同时适用于起始模板量为单染色体或范围在 0.5pg~1 ng 级的 基因组 DNA 。2. 样本收集方式
通过流式细胞仪分选，缓冲液稀释，显微操作和激光显微切割等方式获得的单细胞均可利用本试剂盒进行 全基因组扩增。此外，本试剂盒也适用于经过多聚甲醛固定或激光显微切割的组织细胞样本。3. 样本预处理
为避免细胞准备过程中外源 DNA 的污染，建议在实验前对细胞进行清洗，清洗液为不含 Mg2+ 和 Ca2+的 1×PBS 溶液，需注意，确保后续实验中的 PBS 溶液的体积不超过 2 µL。
实验准备
1. 预扩增样本准备区的隔离
为避免样本受外界因素干扰或 DNA 扩增产物的污染，在扩增前，预扩增样本的准备过程需在单独隔离的 实验室或专门工作区完成，并预备专用的实验材料和仪器，例如，移液器、移液管、PCR 管、1.5mL 的离 心管、离心管架、离心机、漩涡混和仪和实验服等；请将 DNA 扩增产物与预扩增试剂分开储存；所有的下游分析处理，如 DNA 纯化、测序前的准备工作，请
在另一实验室中进行。
2. 对照组 DNA 样本 (5 μL)
阳性对照配置：用无核酸酶水将 DNA 存储液稀释为 30pg/μL的 DNA， 取 30 pg/μL DNA 溶液 1 μL， 加入含 4 μL Cell Lysis Buffer的 PCR 管中，作为阳性对照。
阴性对照配置： 取 1μL 无核酸酶水，加入到含 4μL Cell Lysis Buffer的 PCR 管中，作为阴性对照。
步骤一：细胞裂解
步骤二：MALBAC预扩增
步骤三：指数式扩增
步骤二：MALBAC预扩增
步骤三：指数式扩增
详细操作流程
注意：由于单细胞全基因组扩增实验全程在同一 PCR 管中进行且反应体积较小，因此加液操作时，移液器吸头 不要接触管中液体，避免将单细胞或 DNA 裹挟出反应体系；移液时，请沿管壁小心添加，勿吹打 PCR 管中液 体；反应前，请进行短暂离心（微型离心机，2000 转，3-4 秒），确保反应体系中的液体混和均匀。 使用前请将细胞裂解酶、预扩增酶和扩增酶置于冰浴中，其他组分可在用前置于冰上解冻。步骤一：细胞裂解
1. 根据反应的数量（N），混和 Cell Lysis Buffer 和 Cell Lysis Enzyme ，用于准备细胞裂解混合液。 反应体系如下表：2. 将单细胞收集在含有 5µL 细胞裂解混合液的 PCR 管中（含有单细胞样本的 PBS 溶液体积不得超过1µL）。
3. 在预热的 PCR 仪中孵育样本，条件如下表：
5. 在 5µL 的细胞裂解产物或对照组 DNA 样本中加入 30µL 预扩增混合液（此时反应总体积为 35µL）
6. 在 PCR 仪中扩增，反应条件如下：
| 循环 | 温度 | 时间 |
| 1 | 50℃ | 50 分钟 |
| 80℃ | 10 分钟 | |
| 4℃ | 维持 |
步骤二：MALBAC 预扩增
4. 根据反应的数量（N），混和 Pre-Amp Buffer 和 Pre-Amp Enzyme Mix ，用于准备预扩增混合液 。5. 在 5µL 的细胞裂解产物或对照组 DNA 样本中加入 30µL 预扩增混合液（此时反应总体积为 35µL）
6. 在 PCR 仪中扩增，反应条件如下：
| 循环 | 温度 | 时间 |
| 1 | 94℃ | 3 分钟 |
| 20℃ | 40 秒 | |
| 30℃ | 40 秒 | |
| 40℃ | 30 秒 | |
| 8 | 50℃ | 30 秒 |
| 60℃ | 30 秒 | |
| 70℃ | 4 分钟 | |
| 95℃ | 20 秒 | |
| 58℃ | 10 秒 | |
| 1 | 4℃ | 维持 |
7. 立即进行下一步指数式扩增 。
步骤三：指数式扩增
8. 根据反应的数量（N），混和 Amplification Buffer 和 Amp Enzyme Mix，准备扩增混合液。| 扩增混合液体积 |
| Amplification Buffer (红盖) 30 µLx N Amp Enzyme Mix (红盖) 0.8 µLx N 总体积 30.8 µLx N |
9.在 35µL 的预扩增产物中加入 30µL 扩增混合液（此时溶液总体积为 65µl）。
10. 在 PCR 仪中进行扩增，反应条件如下：
*说明 ：对于 100pg的 gDNA，我们建议设定 14 个循环；对于流式分选等方式获得的单细胞，设定17 个循环；对于 单染色体，设定 19-21 个循环；对于其他种类的细胞或其他方式获得的样本，建议在PCR 前，对循环次数 进行优化。
扩增产物检测
10. 在 PCR 仪中进行扩增，反应条件如下：
| 循环 | 温度 | 时间 |
| 1 | 94℃ | 30 秒 |
| 94℃ | 20 秒 | |
| 17* | 58℃ | 30 秒 |
| 72℃ | 3 分钟 | |
| 1 | 4℃ | 维持 |
扩增产物检测
1. 琼脂糖凝胶电泳
取 5ul 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳（1% 琼脂糖凝胶，110V，25-35 分钟）， 扩增产物大小为300~2000bp， 产物电泳如图 2 所示。2. Nanodrop 定量
对扩增产物进行纯化，纯化产物使用 Nanodrop 进行定量，终产量为 2-5ug。产物保存
纯化产物请保存于 -20℃。
参考文献
- C. Zong, S. Lu, A.R. Chapman, X.S. Xie. Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy Number Variations of a Single Human Cell. Science, 2012, 338, 1622-1626.
- Lu S, Zong C, Xie XS, et al. Probing Meiotic Recombination and Aneuploidy of Single Sperm Copy Number Variations of a Single Human Cell. Science, 2012, 338, 1622-1626.
- Hou Y, Fan W, et al. Genome Analyses of Single Human Oocytes. Cell, 2013, 155(7):1492-506.(Meiotic Recombination)
- Ni X, Zhuo M, Xie XS, et al.Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients. PNAS, 2013, 110(52):21083-8.
- Yu Z, Lu S, Huang Y. Microfluidic whole genome amplification device for single cell sequencing. Anal. Chem., 2014 Oct 7; 86 (19):9386-90.
- Huang J, Yan L, Xie XS, Qiao J, et al. Validation of multiple annealing and looping-based amplification cycle sequencing for 24-chromosome aneuploidy screening of cleavage-stage embryos. Fertil. Steril., 2014, Dec;102(6):1685-91
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